Western blotting

1- Introdução Western blotting (WB) também conhecido como protein blotting ou immunoblotting, é um poderoso e importante método utilizado para imunodetecção de proteínas após a separação destas por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente. Esta técnica permite detectar, caracterizar e quantificar múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades em determinada amostra. A técnica de WB oferece as seguintes vantagens: membranas úmidas são maleáveis e de fácil manuseio; as proteínas imobilizadas na membrana são rapidamente e uniformemente acessíveis a diferentes ligantes; somente uma pequena quantidade de reagentes são necessários para a análise de transferência; é possível fazer múltiplas réplicas do gel; o armazenamento da amostra transferida pode ser prolongado, antes de ser usada e a mesma proteína transferida pode ser usada para múltiplas análises sucessivas. Além disso, em estudos relacionados à detecção de anticorpos e proteínas de agentes infecciosos, este método é considerado altamente sensível e específico, sendo o método de eleição para diagnóstico de inúmeras doenças dos animais. O protocolo básico de WB pode ser resumido nos seguintes passos: preparação das amostras e fracionamento de proteínas, execução da eletroforese em gel, transferência das proteínas separadas do gel para uma membrana adsorvente, bloqueio de ligações inespecíficas, adição de anticorpo específico e detecção da reação. A preparação…

WESTERN BLOTTING (LCM-FMRP-USP) 1) Tampão RIPA (manter em gelo durante utilização; adicionar o inibidor de protease e fosfatase no tubo falcon; verificar se há estoque – Tris, NaCl, EDTA e detergentes).  Para 50 ml de Tampão Tris = 0,3025 g NaCl = 0,4383 g EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) = 18,61 mg Detergentes: Triton X-100 = 500 μl Deoxiglicolato = 500 mg SDS = 50 mg Inibidores protease: Aprotinina = 250 μg PMSF (phenylmethyl sulfonyl fluoride) = 8,71 mg…

Método Western Blotting para a detecção de proteínas (Protocolo) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 2. 2. PROTOCOLOS 4. 2.1 Dosagem de Proteínas – Lowry 4. 2.2 SDS PAGE 6. 2.3 Eletrotransferência.............................................................................................8. 2.4 Immunoblotting ......................….......................................................................9. 2.5 Reação de ECL 10. 2.6 Stripping da membrana 11. 3. REAGENTES E SOLUÇÕES 11. …

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Ciências Básicas Aula Prática 02 – Bioquímica Fundamental (ZAB0361) Western Blotting Mariana Brustello Professor Doutor Marcelo de Cerqueira Cesar Pirassununga – SP Maio/2014 1. Sumário 1. Resumo 1 2. Introdução 1 3. Materiais 6 4.Metodologia 6 4.1 Preparo da amostra do músculo do peixe 6 4.2 Protocolo de transferência do método de Western…

Eletroforese (SDS-PAGE), foram observadas frações protéicas em larvas infectadas, as quais correspondem às proteínas do vírus dengue. Apenas duas pequenas proteínas foram reconhecidas por anticorpos anti-den1 específicos, por meio da técnica de Western blotting. Os resultados desse trabalho sugerem que quando os ovos do mosquito permanecem por muito tempo no ambiente, as chances da ocorrência da transmissão vertical dos vírus dengue aumentam. Pavras-chave: vírus dengue, Aedes aegypti,…

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos Departamento de Ciências Básicas Relatório da Aula Prática 02 - Bioquímica Fundamental Western Blotting- Técnica de Identificação de Proteínas. Pirassununga – SP Maio/2014 Sumário 1. INTRODUÇÃO Todas as moléculas de proteínas são formadas por uma cadeia de aminoácidos, unidos entre si por ligações peptídicas. Os…

abordados, o presente estudo visa descrever o processo de EM no SNP e na musculatura estriada esquelética (MEE) de camundongos em modelo experimental de EM, bem como caracterizar o possível efeito protetor do Sildenafil. Para tanto camundongos C57black6 com 4 semanas serão imunizados, tratados com Sildenafil e os músculos gastrocnêmios dissecados e submetidos aos seguintes procedimentos: avaliação do processo da EM na MEE e no SNP dos camundongos por microscopia óptica com as…

Técnicas Básicas de Biologia Molecular Diamar Costa-Pinto FIOCRUZ Visão da Apresentação PCR Bibliotecas genômica e de expressão Fragmentação - digestão Separação - eletroforese Clonagem molecular Sequênciamento Southern, Northern e Western blotting By Diamar Diagnóstico do século 21 - Podemos fazer análises genômicas, pois a maioria dos cromossomo já estão mapeados. - O projeto genoma tem sido uma grande ferramenta para unir genomas e laboratório clínico.…

(Promega Corporation) Promega Technical Bulletin, 2009 (Promega Corporation) METODOLOGIA • Determinação de danos em DNA pelo ensaio Comet – “Cells embedded in agarose on a microscope slide are lysed with detergent and high salt to form nucleoids containing supercoiled loops of DNA linked to the nuclear matrix…”; – “…loops containing a break lose their supercoiling and become free to extend toward the anode.”. Collins AR, 2004 (Molecular Biotechnology) METODOLOGIA • p53, Bax,…

------------------------------------------------- ou cDNA. ------------------------------------------------- ------------------------------------------------- Southern Blotting É a transferência de DNA desnaturado de um gel de agarose para uma membrana (em geral de nylon ou material semelhante), onde ele poderá ser analisado com o uso de uma sonda de DNA ou de RNA. As figuras abaixo resumem o processo que vai desde a separação eletroforética do DNA fragmentado até a visualização…