Método Western Blotting para a detecção de proteínas

Método Western Blotting para a detecção de proteínas (Protocolo)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 2.
2. PROTOCOLOS 4.
2.1 Dosagem de Proteínas – Lowry 4.
2.2 SDS PAGE 6.
2.3 Eletrotransferência.............................................................................................8.
2.4 Immunoblotting ......................….......................................................................9.
2.5 Reação de ECL 10.
2.6 Stripping da membrana 11.
3. REAGENTES E SOLUÇÕES 11.

1. INTRODUÇÃO

Western blotting é um método em biologia molecular/bioquímica para detectar proteínas em um homogenato (células bem trituradas) ou um extrato de um tecido biológico. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa. As proteínas são então transferidas do gel para uma membrana, onde serão usados como sonda anticorpos específicos à proteína. Como resultado, pode-se examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos.

Preparação dos tecidos
As amostras são homogenizadas por sonicação (quebra das células por ondas sonoras de alta freqüência) ou por força mecânica. Posteriormente, passam por uma série de centrifugações para se isolar as frações do material desejadas.

Dosagem de proteínas
O ensaio de proteína baseado no método Lowry é um método colorimétrico para dosagem da concentração de proteínas. Sua metodologia consiste na construção de uma curva padrão mediante várias diluições de albumina bovina.
Cada diluição é levada para a leitura de suas respectivas absorbâncias no espectrofotômetro, obtendo-se a curva padrão. Utilizamos essa curva para a medida da concentração de proteínas em uma dada solução.

Eletroforese em gel
A eletroforese é a separação de moléculas, conforme o tamanho, a forma ou carga, através da migração das partículas carregadas num determinado meio, sob a influência de uma diferença de potencial. Diferentes suportes podem ser