Extração do dna genómico e quantificação po espetrofotometria. amplificação do dna por pcr e análise por eletroforese.

trabalho Extração e quantificação, por espectrofotometria, do DNA genómico de células hepáticas de um ratinho descendente do cruzamento entre heterozigóticos relativamente ao gene Drg11 para posterior amplificação por PCR de fragmentos de DNA correspondentes ao gene supracitado e ao gene reporte LacZ e análise por eletroforese de modo a determinar o seu genótipo. Métodos • Extração e quantificação do DNA genómico 1- Escolheu-se 1 tubo (caixa a -20ºC) com uma porção de fígado de ratinho, macerou-se o tecido, o melhor possível, com um pistão de teflon e vortexou-se a solução durante 5 minutos. 2- Adicionou-se 400 l de tampão de extração (200mM Tris-HCl pH 7.5; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5% SDS; Proteinase K) e ressuspendeu-se a solução. 3- Incubou-se a solução a 65ºC durante 20 minutos no termomixer. 4- Centrifugou-se a mesma a 13000 rpm durante 5 minutos. 5- Transferiu-se o sobrenadante, contendo o DNA, para novos tubos. 6- Adicionou-se 300 l de isopropanol ao sobrenadante e inverteu-se o tubo várias vezes até visualizar os filamentos de DNA genómico. 7- Centrifugou-se a 13000 rpm durante 5 minutos. 8- Retirou-se o sobrenadante, lavou-se o “pellet” com 200 l de etanol a 70% e centrifugou-se novamente durante 2 minutos. 9- Removeu-se todo o etanol e deixou-se secar o “pellet” a 65ºC (com a tampa do tubo aberta). 10- Dissolveu-se o “pellet” de DNA em 50 l de água e incubou-se a 65ºC durante 10 minutos no termomixer. 11- Para quantificar o DNA,…

A quantificação do DNA após a sua extração é importante para o aperfeiçoamento da qualidade do produto de DNA resultante da PCR (Internacional Society for Forensic Haemogenetics, 1992). O excesso de DNA em uma amostra de PCR poderá saturar a reação, fazendo com que apareça artefatos de técnica e amplificações inespecíficas que podem dificultar a sua análise. Já o sua falta, poderá acarretar na perda de um dos alelos, quando o indivíduo é heterozigoto, ou mesmo na não amplificação dos…

Introdução Através do estudo da expressão gênica, realizados através de Microarray ou PCR em tempo real, por exemplo, se pode comparar células tratadas em diferentes condições, células tumorais e normais, células de diferentes tecidos e fases de desenvolvimento. Particularmente, o estudo da expressão gênica em células-tronco permite ampliar o conhecimento sobre seus mecanismos de diferenciação. RNA RNA DNA DNA Para correta interpretação de dados é necessário o…

Extração, quantificação e amplificação de DNA Data: 02/04 Extração de DNA – Swab oral Nessa aula foi feito a coleta de amostra biológica através de swab oral, para extração do DNA. Para a extração foi utilizado o protocolo abaixo: Adicionar 200 μL de amostra biológica em tudo 1,5mL; Centrifugar a solução por 5 min., 25°C e 11000rpm; Descartar sobrenadante; Adicionar 500 μL de TE (Tris-EDTA); Centrifugar a solução por 5 min., 25°C e 11000rpm; Descartar sobrenadante; Adicionar…

PCR em tempo real Renato S. Carvalho rscarvalho@biof.ufrj.br IFRJ 22/05/09 Definição: Técnica que combina a amplificação de uma sequência de DNA com a detecção do produto amplificado durante cada ciclo da reação Objetivo: Quantificação (absoluta ou relativa) da amostra de DNA/RNA inicial n P=Tinicial(1+E) P=Produto final E=Eficiência da reação T=Template inicial n=nº de ciclos Se a eficiência da reação for 100% P=Tinicial(2)n Teórico Real …

da Segurança Pública Instituto Geral Perícia Instituto de Análises Forenses LAUDO DE EXAME DE DNA LAUDO PERICIAL Nº 1234 REFERÊNCIA: Inquérito Policial nº 4321/2014 da Delegacia de Polícia da Comarca de Itajaí. DOCUMENTO: Of. nº 123/2014 da Delegacia de Polícia da Comarca de Itajaí, solicita o exame de DNA; Laudo Pericial nº 1234/14 do IAF, caracteriza a presença de sangue e seleciona amostras de contraprova. SOLICITANTE: Delegado da Delegacia de Polícia da Comarca de Itajaí.…

Domínios funcionais das DNA binding proteins DNA binding proteins Identificação da periferia da molécula de DNA por proteínas Interações comuns entre aminoácidos e bases nucleotídicas especialmente no sulco maior da cadeia de DNA "major groove" Domínios comuns de ligação ao DNA Helix-turn-helix Homeodomain Zinc-finger Leucine zipper Basic helix-loop-helix Interação de b-sheets com a dupla hélice do DNA Interação de cadeias polipeptídicas com a dupla hélice do DNA…

as descobertas e os avanços originados dentro dos laboratórios de pesquisa das universidades, onde, efetivamente, nasceram as técnicas de análise de ácidos nucleicos. Posteriormente foi descrita a evolução que estas técnicas vêm sofrendo ao longo do tempo até se chegar ao formato atual, passando pela biologia molecular manual e automatizada, abrangendo, basicamente, a PCR e a PCR tempo real. Além disso, foram discutidas e descritas brevemente outras técnicas de amplificação de ácidos…

principalmente, na análise de ácidos nucleicos. As vantagens dos métodos moleculares frente aos métodos convencionais têm favorecido não somente o diagnóstico de patologias e infecções que acometem o homem como também os animais. Diversas técnicas de biologia molecular estão hoje disponíveis para a detecção de variabilidade genética ao nível de sequência de DNA, ou seja, para a detecção de polimorfismo genético. Estas técnicas permitem a obtenção de um número virtualmente ilimitado de…

Metodologias Disponíveis 5 Testes de Ácidos Nucleicos 7 Roche Amplicor System 8 Roche TaqMan HIV-1 Test 10 Abbott m2000 System 13 Versant HIV-1 RNA Assay 16 NucliSens EasyQ® System 17 Versant™ HIV-1 RNA 3.0 21 Artus HI virus QS-RGQ 22 Testes para Proteínas Virais 23 ExaVir™ Load 23 Tecnologias de Detecção da Proteína P24 Viral 24 Preços no Mercado Nacional 25 Conclusão 26 Bibliografia: 28 Glossário: HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana. PCR: Reação em cadeia da polimerase.…