Extração do dna genómico e quantificação po espetrofotometria. amplificação do dna por pcr e análise por eletroforese.

Objectivo do trabalho

Extração e quantificação, por espectrofotometria, do DNA genómico de células hepáticas de um ratinho descendente do cruzamento entre heterozigóticos relativamente ao gene Drg11 para posterior amplificação por PCR de fragmentos de DNA correspondentes ao gene supracitado e ao gene reporte LacZ e análise por eletroforese de modo a determinar o seu genótipo.

Métodos
• Extração e quantificação do DNA genómico
1- Escolheu-se 1 tubo (caixa a -20ºC) com uma porção de fígado de ratinho, macerou-se o tecido, o melhor possível, com um pistão de teflon e vortexou-se a solução durante 5 minutos.
2- Adicionou-se 400 l de tampão de extração (200mM Tris-HCl pH 7.5; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5% SDS; Proteinase K) e ressuspendeu-se a solução.
3- Incubou-se a solução a 65ºC durante 20 minutos no termomixer.
4- Centrifugou-se a mesma a 13000 rpm durante 5 minutos.
5- Transferiu-se o sobrenadante, contendo o DNA, para novos tubos.
6- Adicionou-se 300 l de isopropanol ao sobrenadante e inverteu-se o tubo várias vezes até visualizar os filamentos de DNA genómico.
7- Centrifugou-se a 13000 rpm durante 5 minutos.
8- Retirou-se o sobrenadante, lavou-se o “pellet” com 200 l de etanol a 70% e centrifugou-se novamente durante 2 minutos.
9- Removeu-se todo o etanol e deixou-se secar o “pellet” a 65ºC (com a tampa do tubo aberta).
10- Dissolveu-se o “pellet” de DNA em 50 l de água e incubou-se a 65ºC durante 10 minutos no termomixer.
11- Para quantificar o DNA, preparou-se dois tubos eppendorf: um para diluir o DNA genómico obtido com uma razão de diluição de 1:10, e outro com uma razão de diluição de 1:100 em 200 µl de água. Armazenou-se o DNA genómico restante a 4ºC até à sua utilização na aula laboratorial seguinte.
12- Leu-se a absorvância a 260 nm e a 280 nm no espectrofotómetro.
13- Com os valores de absorvância obtidos, determinou-se a concentração do DNA genómico extraído, utilizando a diluição de 1:100 e também o grau de pureza.
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