Descrição do fundamento da técnica de pcr

1. DESCREVA O FUNDAMENTO DA TECNICA DE PCR.

A PCR (reação em cadeia da polimerase) é a técnica que permite a amplificação do DNA por meio de artifícios de variação de temperatura a duplicação de cadeias de DNA, envolvendo nucleotídeos, seqüências iniciadoras (primers) e enzima polimerases (enzima termoestável) cuja atividade depende de íons Mg++.
Esta técnica revolucionou as pesquisas em biologia molecular, pois até então se demorava muito tempo para a amplificação do DNA. E é realizada em um equipamento automatizado e computadorizado, denominado termociclador, que promove a alternância de temperaturas por determinados períodos de tempo, possibilitando a ocorrência dos ciclos repetitivos de desnaturação de síntese de DNA.
Assim, é possível a obtenção de muitas cópias de uma seqüência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde.
O princípio da PCR envolve três etapas básicas por ciclo, estimuladas pelo calor, que são repetidas por várias vezes: -Fase de Desnaturação: A temperatura é elevada de 94 a 96 °C para que haja a abertura da fita de DNA através da quebra de pontes de hidrogênio, dando origem a duas fitas simples de DNA sobre as quais a síntese posteriormente vai ocorrer. As ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose (ligações covalentes e mais fortes) permanecem intactas.

- Fase de Anelamento ou Hibridização: A temperatura é reduzida entre 50 a 60°C dependendo do comprimento dos primers e da sua seqüência. Ou seja, dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA. Os iniciadores (os primers) marcam as extremidades da seqüência alvo: estes iniciadores são curtas seqüências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases. Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação.

- Fase de Extensão ou Polimerização: Após a ligação dos primers ou iniciadores às seqüências