Relatório de Bioquímica

Introdução:
Existem vários métodos de quantificação de proteínas. A escolha do método adequado depende de vários fatores como natureza da proteína, presença de interferentes, rapidez, sensibilidade e eficiência do método. Métodos como Biureto,
Bradford, ácido biccinconínico e Kjeldahl são bastante utilizados nos laboratórios que empregam a análise de proteínas para diversos fins. Nesta aula prática vamos utilizar o método de Bradford para quantificar proteínas em extrato de batata contendo mitocôndrias isoladas. Desta forma, a quantidade de mitocôndrias será determinada observando-se a quantidade de proteína total no extrato.
No Método de Bradford, um composto conhecido como comassie brilliant blue G-
250 liga-se a proteínas em meio ácido. Estudos sugerem que a forma aniônica deste composto forma complexos com as proteínas (esquema 1). Neste caso, ocorrem atrações eletrostáticas, interações hidrofóbicas e forças de Van der Waals. Tal complexo possui uma coloração azul. A intensidade desta coloração dependerá da concentração de proteínas da amostra e será mais intensa se a concentração for alta. Este complexo formado absorve em 595nm e pode ser lido em um espectrofotômetro.
Procedimento:
Primeiro passo: preparar a curva padrão com a albumina bovina. Os pontos a serem preparados são os seguintes: 0,062mg/ml, 0,125mg/mL, 0,250mg/mL, 0,5mg/mL, 1mg/mL e 2mg/mL. A curva será preparada partindo-se de uma solução de 2mg/ml fornecida comercialmente. Raciocinar: por que se deve preparar uma curva padrão para se realizar uma análise química? Segundo passo: diluir a amostra em água nas seguintes proporções: 1/10, 1/20,1/40 e
1/60 (amostra/água). 1/10= 20µL de extrato + 180µL, 1/20= ? e 1/40= ?.
Raciocinar: por que diluir as amostras?
Terceiro passo: Aplicar 6µL dos pontos da curva padrão e das amostras em uma placa de Elisa. Logo após, adicionar 180µL do reagente commasie blue.
Raciocinar: Que aconteceu quando você adicionou