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Artigo: a clonagem molecular e análise de expressão de glutationa peroxidase e glutationa redutase a partir da Gracilaria lemaneiformis sob estresse por calor
Para analisar o mecanismo de resistência ao stress térmico na alga vermelha Gracilaria lemaneiformis, foram clonadas por meio de PCR de transcrição inversa e rápida amplificação de cDNA as sequências de cDNA que codificam a glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), de duas estirpes do tipo selvagem, que apresenta uma temperatura de crescimento adequado entre 11 e 23ºC, e do tipo cultivar 981, que pode suportar temperaturas de até 26ºC.
A cultivar 981 de G. lemaniformis foram coletados a partir de um campo de cultivo em Shantou, na China e o tipo selvagem foi obtida em Qingdao, também na China. As algas foram cuidadosamente lavadas e cultivadas com água do mar esterilizada.
O RNA total foi isolado a partir de 200 mg de algas frescas das duas estirpes, com base na introdução de RNA kit vegetal puro (TIANGEN, China). Os RNAs foram quantificados por espectrofotometria e verificado executando amostras em 1,0% de gel de agarose a 1 ug, e foi utilizado como iniciador de RT para introduzir um adaptador, uma coluna de oligo (dT) adaptadores de iniciadores (5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT-3´). O cDNA obtido foi utilizado para a clonagem de genes e PCR em tempo real.
Inicialmente, obteve sequências de cDNA parciais de GPx e GR a partir das bibliotecas de SSH das duas estirpes sob estresse por calor. De acordo com a sequência de cDNA conhecida de GPx e de GR, primers GPx-1, GPx-2, GR-1, GR-2 foram concebidos para a 5´-3´ de amplifiação rápida das extremidades RACE de GPx e GR, respectivamente. As sequências de cDNA foram obtidos por sobreposição de três fragmentos de cDNA: finais, 3´ a 5´ finais e região central do cDNA. A análise da homologia da sequência foi realizada usando o programa básico BLAST, buscador alinhamento local, a partir das bases de dados do NCBL. Ponto isoelétrico e peso molecular