Eletroforese

Eletroforese
Originalmente utilzada para separar misturas de proteínas simples, com base na capacidade das proteínas migrarem quando submetidas a um campo elétrico ( dependendo de sua carga líquida, tamanho e forma)
Permite a separação de: * Ácidos nucléicos (DNA e RNA) * Proteinas

* Moléculas separadas por: * tamanho * forma ou conformação * magnitude de cargas * Sob pH fisiológico -> fosfatos ionizados * poliânions correm em direção ao eletrodo positivo * Eletroforese pólo negativo -> pólo positivo
ETAPAS
* Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR, Proteínas, etc...) * Preparar o gel * Aplicar as amostras no gel * Eletroforese * Coloração do gel, Fixação, Documentação

CLASSIFICAÇÃO * Tipos: * - agarose - poliacrilamida desnaturante não desnaturante * Princípios: - carga elétrica e tamanho da molécula (partícula) - pH (focalização isoelétrica) * Detecção: * brometo de etídeo, SYBR, nitrato de prata, fluorescência * substratos específicos (isoenzimas) * Visualização: * UV, direta, câmera * Ácido nucléico exposto a campo elétrico migra para eletrodo na velocidade ou mobilidade proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula * mobilidade: inversamente proporcional ao coeficiente friccional * coeficiente friccional: função do tamanho e forma da molécula e viscosidade do meio
Eletroforese de DNA * AGAROSE: * polissacarídeo linear de galactose com unidades de b-D-galactopiranose com ligações 1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose * PM médio: 120.000 Da
Nucleotídeos são carregados negativamente

Eletroforese em gel de agarose
- Tampão (TAE ou TBE) e agarose
- Concentração agarose varia entre 1 e 3%
- Fundir a agarose no tampão e aplicar na fôrma
- Esperar esfriar, retirar o pente
- Aplicar as amostras no gel
- Iniciar a eletroforese