Clonagem de seqüências genômicas em leveduras

Introdução

A clonagem de cromossomos em leveduras permite a isolação de fragmentos maiores de DNA (até várias megabases), simplificando bastante o mapeamento de cromossomos e a clonagem de fragmentos específicos. Para muitas espécies, incluindo humanos, ratos e moscas, essa técnica consiste em um passo crítico no seqüenciamento completo do genoma. Também é facilitada a modificação do DNA clonado. Fragmentos grandes de DNA não podem ser facilmente modificados pela tecnologia clássica do DNA recombinante, que inclui enzimas de restrição e ligases. Porém fragmentos grandes clonados em leveduras podem der modificados facilmente por recombinação homóloga na levedura hospedeira. Além do mais, leveduras são úteis para se clonar seqüências genômicas que não são clonadas eficientemente em Escherichia coli.

Clonando seqüências genômicas em leveduras O desenvolvimento da clonagem em leveduras foi possível após a identificação dos principais elementos necessários para a propagação de cromossomos em leveduras: um centrômero, uma origem de replicação ou uma seqüência de replicação autônoma, e um telômero. Vários vetores estão disponíveis para a construção de bibliotecas genômicas de DNA, todos eles baseados em uma série de plasmídeos. Os vetores contêm dois marcadores para leveduras e dois telômeros (um em cada braço do vetor). Um dos braços contém um centrômero de levedura e um elemento para o início de replicação. O DNA externo é ligado nos braços do vetor e transformado em esferoplastos de levedura, e então os genes no vetor são selecionados. Normalmente a célula transformada carrega apenas uma cópia da seqüência clonada, porém a introdução de um centrômero adicional pode aumentar o número de cópias para 6-20.

Modificação do DNA em leveduras por recombinação homóloga DNA mamífero clonado em leveduras podem freqüentemente ser manipulados da mesma forma que o genoma das leveduras. A recombinação homóloga pode ser usada para