Bromatologia

4 METODOLOGIA

4.1 Linhagens celulares e tratamento
As linhagens celulares que serão utilizadas neste trabalho são os melanomas humanos metastáticos SK-Mel-19, SK-Mel-28, SK-Mel-103 doadas pela Profa. Dra. Silvya Stuchi Maria-Engler da Universidade de São Paulo. As células serão cultivadas em meio DMEM completo (10% Soro Bovino Fetal e antibióticos – Ampicilina 1% e Estreptomicina 1%) e incubadas em estufa a 37 ºC e 5 % de CO2.

4.2 Citotoxicidade pelo ensaio de Alamar Blue
O ensaio de Alamar Blue será realizado segundo metodologia descrita por Ahmed e colaboradores (1994). O Alamar Blue utiliza a resazurina de cor azul e não fluorescente, é reduzida a resofurin, de cor rosa e fluorescente, e não precipita após ser reduzida; porém o mecanismo pelo qual esse processo ocorre ainda não está bem esclarecido, o que pode ocorrer por reações enzimáticas ou químicas em células viáveis. O Alamar Blue é utilizado em ensaios de citotoxicidade, determinação da função mitocondrial, proliferação e viabilidade celular (BÉNÉRÉ, 2007).

4.3 Exclusão por Azul de Tripan
A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de exclusão por corante Azul de Tripan 0,4% em PBS (FRESHNEY, 1987), no qual as células foram consideradas não viáveis quando, ao se analisar por microscopia óptica, apresentaram a coloração azul em seu interior. Para a realização do ensaio, as células foram semeadas na densidade 1,5 X 104 células por poço em placas de 24 poços. Decorridas 24 h, o meio foi retirado e, então adicionou-se meio com diferentes concentrações do fármaco. A doxorrubicina será utilizada como controle positivo e DMSO como controle negativo. Após o período de tratamento determinado (24/48/72 h) as células serão colhidas e centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante será dercartado e o pellet de células será ressuspendido com 90 µL de meio DMEM completo, aos quais serão adicionados 10 µL de Tripan Blue. Decorridos 2 minutos, 10 µL da suspensão de células será aplicado em uma câmara de