Zimografia

Zimografia

A zimografia é uma técnica proteómica electroforética que permite a visualização do número e tamanho aproximado de enzimas em amostras biológicas, com base na degradação de um substrato co-polimerizado juntamente com os géis de electroforese. No caso das proteases, utilizam-se como substrato a gelatina, caseína, fibronectina e colagénio, entre outros. Esta técnica é muito útil na análise da composição de proteases de amostras biológicas complexas, pois a visualização dessas proteases depende directamente da actividade proteolítica.
A zimografia com substrato de gelatina é uma técnica amplamente usada no estudo de metaloproteases, especialmente as metaloproteases de matriz (MMPs), sendo compatível com o sistema de tampão de Laemmli, comumente utilizado em electroforese SDS-PAGE, o que a torna interessante por ser de simples aplicação, sem grandes modificações em uma técnica já estabelecida. Outras vantagens desta técnica incluem a sensibilidade na faixa de picogramas e o uso de reagentes baratos e acessíveis. Esta técnica consiste em co-polimerizar o substrato de gelatina em um gel comum de SDS-PAGE. Como o substrato está preso nos poros do gel, ele não migra quando é aplicada a corrente eléctrica durante a electroforese. A amostra biológica é desnaturada por SDS, porém não reduzida, e então aplicada no gel para separação. O tampão de solubilização da amostra não deve conter β-mercaptoetanol, para evitar a quebra das pontes de dissulfeto das MMPs, que evitaria a renaturação das mesmas. Após a corrida electroforética, as proteases separadas são renaturadas dentro do gel, por lavagens repetidas com um detergente não-iónico, como o Triton X-100, que substitui o SDS do gel. O gel é então incubado em um tampão adequado, permitindo que as proteases renaturadas realizem a digestão do substrato em uma zona ao redor de sua posição de electroforese. Estas zonas são visualizadas ao corar o gel com Coomassie Blue, onde o gel inteiro fica azul e as áreas de