Purificação de proteínas

COLÓQUIO DAS PRÁTICAS 7 E 8: PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
(SDS-PAGE)

Pré-prática 7: Diálise
A partir das frações purificadas do lisado
(Saccharomyces cerevisiae) – cromatografia de troca iônica. Preparação da amostra para separação SDS-PAGE através da diálise (para remoção de íons que atrapalham nas análises posteriores).
Preparação concluída pela professora/técnicos.

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O que é a diálise?
Separação por diferenças de peso molecular;
Membrana semipermeável;
Força motriz: diferença de concentração em lados opostos (difusão);
Passagem de solutos menores e retenção de solutos maiores; Separação com base na rejeição de tamanho.

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Quantificação de proteínas
A partir dessas amostras purificadas, devemos proceder como na Prática 3 (Quantificação de Proteínas).
Já possuímos a curva padrão de albumina.
Realizar leituras da amostra em 595nm (com as devidas diluições indicadas no procedimento do experimento – Tabela 2).
Determinar a massa de proteína por volume.

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Prática 7: Preparação do Gel

•
Copolimerização
química de monômeros de acrilamida com N,N’metilenobisacrilamida (Bis-acrilamida) na presença de persulfato de amônio e tetrametiletilenodiamina (TEMED).
O TEMED catalisa a liberação de radicais livres do persulfato que, por sua vez, iniciam e aceleram a polimerização. Malha de Poliacrilamida

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Prática 7: Preparação do Gel
Gel de Separação
•4,0 mL de água destilada,
•100 μL de SDS (100 g/L),
•3,33 mL da solução 1 (acrilamida e bis-acrilamida)
2,5 mL da solução 2 (Tris 1,5 M pH 8,8) *
•5 μL TEMED
•50 μL de persulfato de amônio

Adição do SDS:
•Interação da proteína com SDS deixa a proteína com carga total negativa
•Desnatura a proteína na formação de complexo SDS:Proteína

• Adquirem uma forma alongada em forma de tubo cercada de várias moléculas de SDS ao longo da cadeia. 6

Prática 7: Preparação do Gel
Gel de Empilhamento
•3,5 mL de água destilada,
•50 μL de SDS (100 g/L),
•0,65