MIcroscopia

Preparação do material biológico para a microscopia óptica

A fixação
Fixação
Imobiliza, mata e preserva e endurece as células. Torna-as permeáveis aos corantes e produz uma ligação cruzada entre as suas macromoléculas, permitindo que estas permaneçam estabilizadas nas suas posições naturais.

Procedimentos antigos usavam ácidos e solventes orgânicos como o álcool. Diferentes poderes de penetração, portanto usados em combinações. Atualmente usam-se os aldeídos (formaldeído e glutaraldeído) que formam ligações covalentes com os grupos amino-livres das proteínas produzindo ligações cruzadas.
Qualquer tratamento usado na fixação pode alterar a estrutura da célula ou das suas moléculas ∴ uma alternativa é o congelamento rápido.
Vantagens- proteínas bem preservadas
Desvantagens- estrutura fina da célula é destruída pelos cristais de gelo
O tecido congelado é seccionado com um criostato (micrótomo mantido numa câmara a ↓ T)

Embebição
Mesmo após a fixação os tecidos são macios e frágeis e precisam ser embebidos em ceras (MO) e resinas (ME)
1º na forma líquida de seguida na forma sólida (por esfriamento ou polimerização).
O material biológico embebido é seccionado com um micrótomo/ultramicrótomo
O micrótomo é um aparelho com uma lâmina metálica afiada.

Coloração
Depois de fixado e seccionado, o material biológico tem que ser corado para poder ser observado ao microscópio. Uma vez que os corantes têm diferentes afinidades e poderes de penetração têm que ser utilizadas em combinações. Há uma relativa falta de especificidade dos corantes a nível molecular que tem levado ao desenvolvimento de procedimentos de coloração mais seletivos e racionais, particularmente a métodos que revelem proteínas específicas ou outras macromoléculas na célula.
Assim algumas enzimas podem ser localizadas nas células através da sua atividade catalítica.
Regiões mais sensíveis podem ser avaliadas através de fluorocromos