EXTRAÇÃO SEQUENCIAL DE PROTEÍNAS (Osborne, 1924)

EXTRAÇÃO SEQUENCIAL DE PROTEÍNAS (Osborne, 1924)
- pesar 1 g de amostra em erlenmeyer;
- adicionar 10 mL de água destilada para a extração da fração albumina;
- agitar em mesa agitadora orbital durante 30 minutos (180 rpm a 25°C)
- centrifugar a 2240 x G durante 20 minutos e filtrar o sobrenadante para um balão volumétrico de 25 mL;
- repetir o procedimento;
- completar o volume do balão com água destilada;
- ao resíduo da extração anterior adicionar 10 mL de NaCl 0,9% para a extração da fração globulina e realizar a homogeneização, centrifugação e filtração;
- repetir o procedimento;
- completar o volume do balão com NaCl 0,9%;
- ao resíduo da extração anterior adicionar 10 mL de etanol 70% para a extração da fração das prolaminas e realizar a homogeneização, centrifugação e filtração;
- repetir o procedimento;
- completar o volume do balão com etanol 70%;
- ao resíduo da extração anterior adicionar 10 mL de NaOH 0,1 mol/L para a extração da fração das glutelinas e realizar a homogeneização, centrifugação e filtração;
- repetir o procedimento;
- completar o volume do balão com NaOH 0,1 mol/L.
QUANTIFICAÇÃO (LOWRY, 1951)
- adicionar 4 mL da mistura alcalina em tubo de ensaio;
- adicionar 0,5 mL de extrato;
- esperar 10 minutos;
- adicionar 0,5 mL do reagente Folin 2N (1:2); (se for 1N dilur 1:1)
- agitar e deixar em repouso por 30 minutos;
- ler em transmitância a 660 nm.
Obs.: Em caso de amostra de pH ácido, adicionar 0,5 mL de NaOH 1N após o extrato.
CURVA PADRÃO DE ALBUMINA
Tubos 12345678910
Água 10,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0Albumina 00,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 1- adicionar 4 mL de mistura alcalina em tubo de ensaio;
- adicionar 1 mL de extrato;
- esperar 10 minutos;
- adicionar 0,5 mL do reagente Folin 2N (1:2); (se for 1N dilur 1:1)
- agitar e deixar em repouso por 30 minutos;
- ler em transmitância a 660 nm.
Soluções padrão de albumina (1 mg/mL)
- álcool 30%
- NaCl 0,9%
- Água
- Tampão fosfato 0,1 M pH 7