Extração do DNA

1. Extração de DNA genômico total de leveduras Vários procedimentos de extração de DNA de tecidos vegetais ou de microrganismos têm sido descritos na literatura. O que se observa em geral é que protocolos padrão são utilizados com algumas modificações visando resolver os problemas específicos da espécie em estudo. Os protocolos se caracterizam por utilizar o detergente catiônico CTAB (‘cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide’) no tampão de extração e são, portanto, comumente denominados de protocolos CTAB; ou fenol (Figura 6). A maioria dos protocolos de extração de DNA envolvem em geral cinco etapas básicas. Na primeira etapa, algum tipo de maceração mecânica é utilizada para romper as paredes e membranas celulares das células microbianas, crescidas em meio líquido e separadas desse por filtração ou centrifugação, normalmente feita na presença de nitrogênio líquido. Na segunda etapa, as células maceradas são ressuspendidas em um tampão de extração, contendo algum detergente (SDS no caso da extração que utiliza fenol), antioxidantes, EDTA e agente tamponante, visando a solubilização de membranas lipoproteicas e desnaturação de proteínas enquanto o DNA é protegido da ação de enzimas de degradação. Esta suspensão é submetida a uma temperatura entre 50 e 65
0 C durante 15 a 60 minutos para facilitar a solubilização e homogeneização da suspensão. Na terceira etapa, esta suspensão é submetida a uma extração com um solvente orgânico, clorofórmio-alcool isoamílico. As fases orgânica e aquosa são separadas através de centrifugação. Nesta extração, lipídios, proteínas e a maioria dos polissacarídeos são retidos na fase orgânica inferior , enquanto que o DNA,
RNA e alguns polissacarídeos são retidos na fase superior (aquosa). Na quarta etapa, um álcool (isopropanol ou etanol) e sal (NaCl) são adicionados à fase aquosa. O DNA na presença de sal e álcool forma um precipitado frequentemente visível que pode ser