Extração DNA

PRÁTICA II- EXTRAÇÃO DE DNA

Prof. Leocir J. Welter
MATERIAIS UTILIZADOS:
Micropipeta P1000, ponteiras P1000, microtubo de 2 ml e 1,5 ml, bastão de vidro, 100 mg de tecido vegetal de videira.
REAGENTES UTILIZADOS:
Tampão de extração de DNA (Composição: PVP 2%; CTAB 2%; NaCl 1,4 M; EDTA 0,02 M; Tris HCl 0,1 M, 0,2% de β-Mercaptoetanol); Clorofórmio-Álcool isoamílico (24:1); Isopropanol; Álcool absoluto; Álcool 75% e RNAse diluída em água ultrapura autoclavada (20 µg/ml).
PROCEDIMENTOS:
1. Recorte quatro discos foliares de 12 mm (± 100 mg) de folhas frescas e adicione-os em um microtubo de 2 ml;
2. Adicione 700 µl de tampão de extração pré-aquecido a 65oC de DNA e macere bem as folhas com o bastão de vidro;
3. Acomode os microtubos em banho maria a 65oC durante 10 min;
4. Retire os microtubos do banho maria e deixe-os resfriar na bancada por 2 min.;
5. Adiocione 700 µl de Clorofórmio-Álcool isoamílico (24:1);
6. Inverta os microtubos gentilmente por 5 min.;
7. Centrifugue os microtubos durante 5 min. a 13.000 rpm;
8. Retire o sobrenadante e pipete-o em um novo microtubo de 1,5 ml;
9. Adicione 330 µl de Isolpropanol gelado e inverta o tubo gentilmente;
10. Acondicione o microtubo no freezer (-18oC);
...
11. Centrifugue o microtubo durante 5 min. a 13.000 rpm;
12. Descarte o sobrenadante com cuidado para não perder o pellet de DNA e adicione 400 µl de álcool 75%;
13. Centrifugue o tubo novamente por 5 min. a 13.000 rpm;
14. Descarte o sobrenadante com cuidado para não perder o pellet de DNA e adicione 400 µl de álcool absoluto;
15. Centrifugue o tubo novamente por 5 min. a 13.000 rpm;
16. Descarte o sobrenadante e deixe o pellet secar a temperatura ambiente durante 2 horas;
17. Adicione 30 µl de RNAse e mantenha os tubos em repouso em temperatura ambiente por 3 horas;
18. Armazene o DNA em freezer (-18oC) até o seu uso.

Leitura complementar:
Romano, E.; Brasileiro, A.C.M. Extração de DNA de plantas. Biotecnologia Ciência &