Cultura de células

MATERIAIS
1. Ensaio MTT: Uma solução de estoque de 3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) será preparada para dar uma concentração de 12 mM em PBS e armazenada a 4 ° C no escuro. Solução-mãe de tampão de lise celular foi preparada através da dissolução de 0,7 decanosulfonato de sódio (SDS) em 5 0% dimetilformamida (DMF) com o pH ajustado para 4,7 pela adição de ácido acético glacial anidro.
2. Ensaio DCF-DA: Meio de cultura Phenol red-free RPMI 1640 (PAA, UK). Será suplementado com penicilina / estreptomicina (50 U / ml) e armazenada a 4 ° C. 2', 7'-Dichlorofluoresciena diacetato (DCFH-DA) solução estoque será feito por dissolução em DMSO a uma concentração de 10 mM e armazenada a -20 ° C no escuro.
3. Análise do Ciclo Celular: De tampão de fixação celular será preparado com 1% v/v formaldeído em PBS. Tampão de permeabilização celular será preparado imediatamente antes da utilização pela dissolvendo 0,5% v/v de albumina de soro bovino (BSA) em PBS com 0,25% v/v de Triton X-100. Anticorpo anti cyclina anti-humano produzido em rato A-FITC (BD Biosciences, Reino Unido).
4. Ensaio Anexina V Apoptose: O kit de detecção de apoptose anexina V (Abcam, Reino Unido), com tampão de ligação anexina V-FITC e uma solução pronta de iodeto de propídio.
5. Eletroforese e Western Blot: As amostras celulares serão aplicadas à tiras de 7cm pH imobilizado 3-10 (IPG, GE Healthcare, Piscataway, NJ). A focalização isoelétrica será feita com a utilização do equipamento Multiphor II (GE, USA). As tiras serão equilibradas com tampão contendo glicerol 30 %, uréia 6 M, DTT 1 % e SDS 20 %, por 10 minutos a temperatura ambiente e depois com o mesmo tampão com a adição de 4 % de iodacetamida por 10 minutos para a eletroforese. Após o equilíbrio das tiras as proteínas serão separadas por eletroforese de acordo com suas massas moleculares, utilizando um gel 12% de poliacrilamida e um gel de empacotamento 5%. A eletroforese será realizada com tampão de corrida (Tris base