Cromatografia de gel de filtração

1. Introdução

A cromatografia líquida de gel filtração, também chamada de exclusão molecular, é um método para purificação e análise de macromoléculas. Este método consiste na separação de biomoléculas de acordo com seu tamanho e forma. A coluna contém um polímero com ligações cruzadas com poros de tamanho definido. Moléculas maiores migram mais rapidamente que as menores porque não conseguem penetrar no interior dos poros da resina, eluindo diretamente da coluna. As moléculas menores, por entrarem pelos poros da coluna, e levarem mais tempo percorrendo os "labirintos", eluem tardiamente em relação às maiores. É interessante salientar que enquanto a cromatografia de troca iônica e de afinidade permitem a concentração das macromoléculas a serem analisadas, a cromatografia de gel filtração dilui a amostra por requerer um fluxo contínuo de solvente. Entretanto, é um método poderoso para purificação e determinação da massa molecular. Pode também ser aplicada como um método rápido de dessalinização de soluções.

2. Procedimento

Soluções

▪ Azul de Dextran a 10 mg/mL em água destilada – ARMÁRIO ▪ Vermelho de Fenol a 1 mg/mL em água destilada – ARMÁRIO

Operação

▪ A resina Sephadex é guardada em azida sódica (extremamente tóxica) e deve ser transferida com uso de material de proteção adequado;

▪ Deixar a resina em, aproximadamente, 15 mL de solução;

▪ Colocar um pequeno chumaço de lã de vidro ou algodão hidrofílico na extremidade da coluna. Use uma pipeta de 1 mL para auxiliá-lo na colocação do algodão nas colunas (CUIDADO COM A LÃ DE VIDRO. NÃO A MANUSEIE SEM LUVAS!!);

▪ Prender as colunas verticalmente em um suporte universal;

▪ Preparar a cama, depositando continuamente a resina (Sephadex) na coluna. Empacotar a coluna por cerca de 10 min. NUNCA DEIXE A COLUNA SECAR!!!

▪ Pré-eluir a coluna de Sephadex com PBS 1x durante 10 min para retirar completamente a azida sódica; ▪ Parar de injetar PBS e