Cromatografia de filtração em gel

Bioquímica I – 2008/2009

Trabalho práctico 3
“ Separação de compostos biológicos – cromatografia de filtração em gel “

Resumo

Este trabalho teve como objectivo a separação de uma proteína, nomeadamente a hemoglobina, de outros componentes com peso molecular inferior, numa coluna de cromatografia de exclusão molecular. Á medida que esta separação era efectuada, foi comprovada a reacção desta proteína com os respectivos componentes através de mudanças de cor. Obtiveram-se dois volumes de eluição V0 e Vi. V0 corresponde ao volume de hemoglobina e Vi é o volume dos restantes solutos envolvidos na cromatografia realizada.

Resultados

V0 – 11 mL
Vi – 8 mL

Discussão dos resultados

A cromatografia de filtração em gel tem por base a separação de moléculas (neste caso, a separação da oxihemoglobina, uma forma de hemoglobina, do soluto ferricianeto de potássio – K3Fe(CN)6) de forma fraccionada por ordem decrescente do seu peso molecular. As moléculas de tamanho superior aos poros do gel Shephadex (gel utilizado), não passam através destes mas sim entre os seus espaços intersticiais e, devido a este facto, são as primeiras a serem eluídas da coluna (V0) ; as moléculas com tamanho suficientemente pequeno para que possam entrar nos poros, serão as últimas a serem eluídas (Vi ). Desta forma, a hemoglobina surge mais rapidamente no fundo do leito da coluna, enquanto que o ferricianeto de potássio fica retido no seu interior durante mais tempo. Isto só é possível se for depositada na coluna solução tampão após a adição da solução de metahemoglobina com ferricianeto de potássio. Esta mesma solução possuia inicialmente uma cor castanha dado que o ião Fe2+ existente no interior do anel de porfirina da oxihemoglobina foi oxidado a Fe3+ com ferricianeto de potássio e não está ligado a moléculas de oxigénio. Seguidamente ocorreu uma mudança de castanho para roxo, já que o respectivo ião Fe 3+ foi reduzido a Fe2+ com o ditionito de sódio existente na coluna,