Extração do dna genómico e quantificação po espetrofotometria. amplificação do dna por pcr e análise por eletroforese.

espectrofotometria, do DNA genómico de células hepáticas de um ratinho descendente do cruzamento entre heterozigóticos relativamente ao gene Drg11 para posterior amplificação por PCR de fragmentos de DNA correspondentes ao gene supracitado e ao gene reporte LacZ e análise por eletroforese de modo a determinar o seu genótipo. Métodos • Extração e quantificação do DNA genómico 1- Escolheu-se 1 tubo (caixa a -20ºC) com uma porção de fígado de ratinho, macerou-se o tecido, o melhor possível, com um pistão de teflon e vortexou-se a solução durante 5 minutos. 2- Adicionou-se 400 l de tampão de extração (200mM Tris-HCl pH 7.5; 250mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5% SDS; Proteinase K) e ressuspendeu-se a solução. 3- Incubou-se a solução a 65ºC durante 20 minutos no termomixer. 4- Centrifugou-se a mesma a 13000 rpm durante 5 minutos. 5- Transferiu-se o sobrenadante, contendo o DNA, para novos tubos. 6- Adicionou-se 300 l de isopropanol ao sobrenadante e inverteu-se o tubo várias vezes até visualizar os filamentos de DNA genómico. 7- Centrifugou-se a 13000 rpm durante 5 minutos. 8- Retirou-se o sobrenadante, lavou-se o “pellet” com 200 l de etanol a 70% e centrifugou-se novamente durante 2 minutos. 9- Removeu-se todo o etanol e deixou-se secar o “pellet” a 65ºC (com a tampa do tubo aberta). 10- Dissolveu-se o “pellet” de DNA em 50 l de água e incubou-se a 65ºC durante 10 minutos no termomixer. 11- Para quantificar o DNA, preparou-se dois tubos eppendorf: um para…

Domínios funcionais das DNA binding proteins DNA binding proteins Identificação da periferia da molécula de DNA por proteínas Interações comuns entre aminoácidos e bases nucleotídicas especialmente no sulco maior da cadeia de DNA "major groove" Domínios comuns de ligação ao DNA Helix-turn-helix Homeodomain Zinc-finger Leucine zipper Basic helix-loop-helix Interação de b-sheets com a dupla hélice do DNA Interação de cadeias polipeptídicas com a dupla hélice do DNA…

pTZ57R/T ligado a um fragmento de DNA de 953 pares de bases e realização de uma extração plasmidial a partir de uma colônia previamente preparada. 2. Introdução: 2.1. Processo de Clonagem do DNA in vivo: A tecnologia do DNA recombinante consiste em um conjunto de técnicas que permite identificar, isolar e multiplicar um gene interesse, tendo como objetivo determinar o seqüenciamento destes, sua atividade e consequentemente sua expressão gênica. Em suma, o processo de…

clonagem em E. coli de produção de DNA de cadeia simples Preparação de bibliotecas genómicas Preparação de bibliotecas de cDNA Desenvolvimento da clonagem molecular An Introduction to Genetic Engineering Definição de clonagem molecular A clonagem molecular é o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a selecção do DNA recombinante. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos,…

os fragmentos de DNA sejam clonados e propagados em uma célula hospedeira adequada. Um vetor de clonagem é uma molécula de DNA que tem 3 características fundamentais: • É capaz de replicar independentemente do cromossomo da célula hospedeira → Origem de replicação. • Organismos contendo o vetor podem se desenvolver preferencialmente em um dado meio, pois o vetor confere ao organismo alguma propriedade que lhe permite este crescimento preferencial → Resistência a antibiótico. …

Estudo dirigido Engenharia genética. Iara Barros e Aline Maria Capítulo 5 – Introdução de DNA em células vivas 1) Para que serve a clonagem gênica? Clonagem gênica (técnica do DNA recombinante) consiste na inserção de um segmento selecionado de DNA em um plasmídeo ou no cromossomo de um bacteriófago, que atuam como vetores de clonagem e posterior replicação desses DNA recombinante em um hospedeiro apropriado, como uma bactéria ou uma célula de levedura. A replicação ocorre quando…

" FE-UCP - !" Relatório/Aula Laboratorial UNIVERSIDADE CATÓLICA PORTUGUESA FACULDADE DE ENGENHARIA BIOTECNOLOGIA Licenciatura em Engenharia Biomédica Ano Lectivo 2011/2012 – 2º Semestre/3ºAno RELATÓRIO DA ACTIVIDADE PRÁTICO-LABORATORIAL: Produção do plasmídeo pVAX-LacZ em Escherichia coli DH5!, para utilização em terapia génica ou vacinas de DNA Lista de Abreviaturas mL p/V g g/L mg NaOH HCl Abs600 NaCL µL nm Mililitros Partes por volume Gramas Gramas por Litro Miligramas…

Clonagem de DNA CLONAGEM DE DNA • CLONAGEM: é multiplicar assexuadamente. Na Biologia Molecular, significa mais especificamente crescer uma colônia de bactérias a partir de uma célula única. Clonagem de genes é essencialmente o processo de amplificar seletivamente um gene particular, incorporando-o numa bactéria e clonando a bactéria. Primeiros experimentos bem sucedidos de clonagem foram mostrados no início da década de 1970. Avanços conceituais e tecnológicos que contribuíram para…

Capítulo 1 Vera Lúcia da Silva Valente Gaiesky Ferramentas Metodológicas 1. Tecnologias de DNA recombinante 2 1.1 Hibridização in situ 2 1.2 Reação em cadeia da polimerase 4 1.3 Vetores de clonagem e de expressão 4 1.4 Organismos transgênicos 5 1.5 Outros métodos 9 Embriologia 2 O avanço científico observado nas últimas décadas propiciou que fossem desenvolvidas novas ferramentas (técnicas e métodos) para o estudo da biologia do desenvolvimento, o que permitiu explorar…

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Alexandra A. C. Nascimento Enilza Maria Espreafico Maria Luisa Paçó Larson Nádia Monesi Nilce Maria Martinez Rossi Vanderlei Rodrigues Revisão 1: Eliana Valéria Patussi Márcia A. S. Graminha Revisão 2: Fábio Márcio Squina Josane de Freitas Sousa Roberto Ruller Valeria Valente 2003 I. CONCEITOS BÁSICOS 1. INTRODUÇÃO Até a década de 70, o DNA era o componente celular mais…