Extração plasmidial

1. Objetivos:

Obtenção de colônias recombinantes de E.coli DH5α a partir da transformação do vetor pTZ57R/T ligado a um fragmento de DNA de 953 pares de bases e realização de uma extração plasmidial a partir de uma colônia previamente preparada.

2. Introdução:

2.1. Processo de Clonagem do DNA in vivo:

A tecnologia do DNA recombinante consiste em um conjunto de técnicas que permite identificar, isolar e multiplicar um gene interesse, tendo como objetivo determinar o seqüenciamento destes, sua atividade e consequentemente sua expressão gênica. Em suma, o processo de clonagem de um gene de interesse consiste em extrair esse gene, clivá-lo em posições bem definidas (obtendo-se um fragmento) com uma enzima de restrição específica, isolá-lo por eletroforese. Concomitantemente, cliva-se com a mesma enzima de restrição utilizada anteriormente um vetor cujas propriedades sejam de interesse. Faz-se então a ligação entre o fragmento de DNA e o vetor escolhido, utilizando-se uma enzima de ligação, obtendo-se um DNA recombinante. Este será inserido em uma célula hospedeira, geralmente uma bactéria, ocorrendo o processo de transformação, ou seja, a DNA polimerase da bactéria fará a multiplicação dos DNAs recombinantes, em um meio de cultura que contenha substrato para a bactéria.

Figura 1: Clonagem do DNA

É importante ressaltar que a ligação entre o vetor escolhido e o fragmento de DNA de interesse pode ou não acontecer, portanto, quando ocorrer o processo de transformação, obtêm-se hospedeiros com o DNA recombinante, hospedeiros apenas com o vetor e hospedeiros sem nenhum dos dois.

2.2. Transformação de Bactérias competentes:

A transformação de bactérias é requisito básico para a clonagem e replicação do fragmento de DNA desejado, sendo que para isso é necessária a inserção do DNA recombinante na célula bacteriana. Pelo fato de ser uma bactéria muito bem conhecida e que compõe a flora intestinal dos seres