Técnica de Biologia Molecular

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
Instituto de Biologia — Departamento I — Biologia Geral

Técnicas de Biologia Molecular 2
Sequenciamento de DNA

Salvador,
Maio de 2012

Sequenciamento de DNA

No início da década de 80 uma técnica relativamente rápida de sequenciamento de
DNA foi desenvolvida, que empregava a quebra de uma cadeia de DNA com diferentes produtos químicos e a visualização dos fragmentos gerados por eletroforese.

Poucos anos depois um novo avanço tecnológico foi alcançado pela introdução da técnica de interrupção da sequência pela incorporação aleatória de um nucleotídeo modificado (sem a hidroxila na posição 3´), que ficou conhecida como técnica de didesoxi ou dideoxi.
Esta técnica suplantou imediatamente a anterior e permitiu o desenvolvimento de sequenciadores automáticos de DNA. Ainda se faz eventualmente o sequenciamento manual, mas é muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois emprega substâncias radiativas. Método
Um dos métodos mais usados é a “técnica de desoxi”, também conhecida como terminadores de cadeia ou Sanger (em homenagem a Fred Sanger, que propôs a técnica em questão).
O precursor normal da síntese de DNA é o dNTP, ou desoxiribonucleotídeo trifosfato, que apresenta uma hidroxila na posição 3´.
É a partir desta hidroxila que a fita nascente é estendida. Um ddNTP, entretanto, não tem esta hidroxila.

Logo, se for incorporado a uma fita de DNA, interrompe a incorporação de outros nucleotídeos a partir dele. Se o ddNTP for marcado associado à radiação ou fluorescência, a fita interrompida ficará radiativa ou fluorescente e poderá ser detectada mais facilmente.

Método
Estão presentes nessa técnica dois tipos de marcadores nucleotídeos: os “normais”
(deoxi) – dATP, dGTP, dCTP e dTTP; e os dideoxinucleotídeos (não possuem o grupo hidroxila no carbono 3’) – ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP, sendo estes marcados com material fluorescente.
Para fins vamos admitir que cada didesoxinucelotídeo