Protocolo Mic Em Microplaca

Universidade Federal de Goiás
Laboratório de Biologia Molecular

Protocolo da concentração inibitória mínima de compostos em
Paracoccidioides brasiliensis

Inóculos
1. 2/3 de um tubo de Pb em 100 ml de meio Fava neto liquido por 72 horas,
2. Centrifugar as células (3000 rpm por 10 minutos), desprezar o sobrenadante, realizando a lavagem com PBS 1xavagem
2 vezes PBS 1X– centrifugando e desprezando o sobrenadante
Após a segunda lavagem e após desprezar o sobrenadante passar para o meio RPMI 1640 sem bicarbonato, deixando overnight ou por 16 h.
Poderá ser utilizado outros meios quimicamente definido como Meio MVM.

CIM – CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
1. Centrifugar as células que estavam em RPMI 1640 (3000 rpm por 10 minutos), desprezando o sobrenadante. Fazer a lavagem
2. Proceder a lavagem das células
2 vezes em PBS 1x – centrifugando e desprezando o sobrenadante,
Após a segunda lavagem e após desprezar o sobrenadante, ressuspender em cerca de 10 ml de meio RPMI.
3. Passar lentamente a suspensão do Pb na seringa por 2 vezes para desfazer os grumos.
4. Diluir o PB para a contagem: 190 µl trypan, 800 µl solução salina,10 µl de Pb. Homogeinizar no vortex, pipetar 10 µl na câmara de Neubauer e realizar a contagem. o número de células seguirá a seguinte fórmula
Média do numero de células dos 4 quadrantes contagem x 102 (fator de diluição) x. 104 (fator de correção da câmara de neubauer)= número de células.
1. Determinar qual concentração final de célula que será usador em um volume final de 200 µl (volume máximo utilizado na microplaca). Para isso usar a fórmula C1.V1 = C2.V2

Exemplo: C1.100 µl = 1x103.200 µl
Concentração inicial para que pegue 100 µl e no final de 200 µl tenha o tanto de células que desejar. C1 = 2x103 cél/ml
Após
C1.V1 = C2.V2
Número de células contagem . V1 = 2x103 . volume que deseja de suspensão (10 ml)
5. Determinar as concentrações a serem testadas.
6. Dilui de forma seriada as suas concentrações partindo da solução mãe
7.