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4) Qual a melhor formulação para obtenção de alta densidade celular?

A melhor formulação é a ZYM-505. As condições de cultura de alta densidade desenvolvidos para auto-indução, também são convenientes para a preparação de DNAs de plasmídeo. Meios de enriquecimento, tais como ZYM-505, auxiliam o crescimento das linhagens com plasmídeos com densidades de cultura de A600~10 ou superior quando 1.5- 2,5 ml de cultura é desenvolvida num tubo de 18x150 milímetros agitado a 300-350 rpm. A lactose é omitida, a não ser que a auto-indução seja desejada. A presença de 0,05% de glicose, assegura crescimento inicial rápida com pequeno atraso. Normalmente, os rendimentos de DNA de plasmídeo foram várias vezes maiores do que o obtido em meios utilizados anteriormente com esta finalidade, e um único tubo de microcentrífuga de 1,5 ml geralmente fornece mais DNA de plasmídeo do que o necessário para a maioria dos propósitos. Aeração adequada garante crescimento a altas densidades, mas mesmo aeração moderada dá altos rendimentos.

5) Qual o efeito do pH sobre o crescimento celular? Foi adotada alguma estratégia para o seu controle? Se sim, qual?

As culturas que crescem em meios contendo glucose (e em que nenhum outro nutriente é limitante) vai continuar a crescer até que a glicose se esgotar ou o ácido gerado pelo metabolismo de glicose for superior a capacidade de tamponamento do meio e faz com que o pH caia para um nível que impede o crescimento. A estratégia utilizada foi a de utilizar o fosfato 100 mM em meio P, pois fornece suficiente capacidade tampão para permitir o crescimento de esgotamento de 0,5% de glicose com uma densidade maior do que saturação A600~5 enquanto se mantém o pH acima de 6,0. No entanto, o significativo aumento da concentração de glicose ou diminuições em concentrações de fosfato geralmente produzem culturas que saturaram em pH baixo e perderam a viabilidade dentro de horas ou dias. Numa tentativa de proporcionar um tampão forte contra a