MATERIAIS E M TODOS

1. MATERIAIS E MÉTODOS

1.1. AMOSTRAS
Serão analisadas amostras de lactose. As soluções de lactose serão preparadas na concentração 1 mM imediatamente antes do uso, a lactose será solubilizada em água destilada, deionizada e estéril. A concentração utilizada nos ensaios é de 0,025 mM.
1.2. LINHAGENS
A linhagem utilizada para os ensaios da análise da atividade antioxidante, serão utilizadas linhagens proficientes e deficientes em sistema de defesa antioxidante (SOD, sod1, sod2, sod1sod2). A linhagem EG118 é defectiva no sistema enzimático que envolve a enzima superóxido dismutase citoplasmática (CuZnSOD – produto do gene SOD1), enquanto a EG110 é na SOD mitocondrial (MnSOD – produto do gene SOD2); EG133 é o duplo mutante, defectivo para SOD1 e SOD2; EG103 corresponde à linhagem selvagem, portanto proficiente nestas enzimas.
1.3. CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO
Células em fase estacionaria de crescimento serão obtidas a partir de uma colônia isolada, retirada da placa e colocada para crescer em meio liquido YEL, por 48 horas, a 30ºC, até atingir uma concentração de aproximadamente 2-4 x10⁸ células/mL. As linhagens de EG103, EG118, EG110 e EG113 não serão crescidas com agitação, a fim de evitar o acumulo de supressores. Culturas em fase exponencial serão obtidas por incubação de 2x106 celulas/mL de uma pré-cultura em fase estacionaria, também em meio YEL. Após cerca de 4 horas de incubação, nas mesmas condições acima descritas, a cultura alcança a fase exponencial de crescimento (1-2x107 celulas/mL), com uma percentagem de 50-70% brotos.
1.4. AGENTE ESTRESSOR
Como agente estressor será utilizado o peróxido de hidrogênio preparado em água destilada, deionizada e estéril na concentração 2 mM. A concentração final empregada nos testes é de 10M.
1.5. MEIOS DE CULTURA E SOLUÇÕES
Para a cultura das células da levedura empregar-se-á meio YEL – 1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona e 2% de glicose. Em meio YEPD solidificado – 2% de bacto-ágar. 0,9% de solução salina e