Etapas do PCR

REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO
EM CADEIA (PCR)

Introdução
A técnica da PCR permite que um fragmento específico da molécula de DNA seja amplificado milhares de vezes em apenas algumas horas. A partir da PCR é possível obter-se cópias de uma parte do material genético em quantidade suficiente que permita detectar e analisar a sequência que é alvo do estudo.
A reação explora função natural da enzima chamada de taq-polimerases, extraída da bactéria Thermus aquaticus, ciclos passa por diferentes temperaturas.
As etapas do processo consistem em Extração do DNA da amostra que se pretende estudar purificação do DNA, preparação de uma mistura chamada Master Mix, que conterá todas as substâncias necessárias à síntese de novas cópias de DNA, incubação em um termociclador, que é o aparelho responsável pela execução de todos os ciclos da reação aquecendo e resfriando os tubos, eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos da PCR, revelação e fixação do gel
Ocorre em 3 etapas distintas:
a) Desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado;
b) Anelamento ou hibridização - ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado;
c) Extensão ou seja a polimerização propriamente dita
Reagentes da PCR: Solução tampão para se garantir pH e concentrações iônicas adequadas à reação, deoxinucleosídeos trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) que atuam como tijolos na construção das moléculas de DNA, os primers, a Taq-polimerase, H2O, Mg+2 para optimizar a reação (nem sempre é usado), O DNA extraído da amostra, alguns adjuvantes quando necessário.

ETAPAS
1) Etapa de desnaturação. Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 º C promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de