Revisão sobre tecnicas moleculares

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA

O avanço na área de marcadores moleculares baseados em PCR ocorreu em 1990, com a idéia de se utilizar primers mais curtos e de seqüência arbitrária para dirigir a reação de amplificação, eliminando assim a necessidade do conhecimento prévio da seqüência a ser amplificada. Esta técnica foi desenvolvida independentemente por dois grupos de pesquisadores nos Estados Unidos. WILLIAMS et al. (1990, p. 6531-5) patentearam a tecnologia com o nome mais comumente utilizado, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, isto é, DNA polimórfico amplificado ao acaso). WELSH & MCCLELLAND (1990, p. 1273-318), por sua vez, propuseram outra denominação para a técnica, chamando-a de AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction) uma vez que os primers possuem seqüência arbitrária mas a amplificação tecnicamente não ocorre ao acaso e, sim, em lugares específicos no genoma. Esta técnica também pode ser descrita com o nome de DAF (DNA Amplification Fingerprinting), proposto por CAETANOANOLLÉS et al. (1991, p. 553-7a, 1991, p. 295-307 b), para detectar diferenças genéticas entre organismos.
A técnica de RAPD é basicamente uma variação do protocolo de PCR, com algumas características distintas: utiliza tipicamente como primer um único oligonucleotídeo, contendo de 9 a 10 bases, sendo este normalmente formado por diferentes combinações das quatro bases nitrogenadas, com um conteúdo de G+C entre 50 e 70% (Fritsch & Rieseberg, 1996). Sua seqüência é construída aleatoriamente, o que resulta na amplificação de uma seqüência alvo desconhecida, daí serem chamados de primers aleatórios ou arbitrários. Entretanto, recentemente, podemos encontrar trabalhos na literatura que utilizam primers maiores (20 bases) para obtenção de dados sobre polimorfismo, pela técnica de RAPD (GUERRERO et al., 1997, p. 745-55).
O princípio da técnica é muito simples: o primer se liga à seqüências complementares em fitas opostas do DNA alvo e ocorre a amplificação in