Reação de polimerase em cadeia - pcr

Termociclador

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

Técnica que permite a amplificação da quantidade de DNA específico

utilizando a enzima Taq DNA polimerase, sequências iniciadoras específicas (primers) e variações de temperatura controladas.

ETAPAS DO PCR
1. Adição de reagentes
DNA

ETAPAS DO PCR
1. Adição de reagentes
DNA

dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos)

ETAPAS DO PCR
1. Adição de reagentes
DNA

Taq polimerase Primers Tampão Água

dATP dCTP dGTP dTTP (nucleotideos)

Taq DNA polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

Taq DNA polimerase

Termoestabilidade limitada
Temperatura 92,5oC 95,0oC 97,5oC T 1/2 (minuto) 130 40 5

Taq DNA polimerase
 Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida durante 45 minutos a 95°C. • Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que cada U é definida como a quantidade de enzima capaz de incorporar 10 nM de dNTP em cerca de 30 min a 72°C.

• Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U (0,5 l) de enzima em volume final de 100 l.
• É importante deixar claro que o excesso de enzima também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo inclusive inibi-la.

Seqüências dos primers

• Os primers (forward e reverse) devem ser construídos de acordo com a conveniência do investigador, de modo que esses possuam seqüências complementares a determinadas regiões do DNA que limitam os segmentos a serem amplificados.

Problemas comuns no Desenho de Primers
• Auto-complementariedade • Complementariedade entre primers

Auto Complementariedade
• Formação de alça
GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT

HOTGACTTC

ACTGAA

Tm = 71oC

Complementariedade entre

Primers

• Formação de “primer dimer”
5’ GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH3’ 5 ‘ CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH3’

3’OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH3’

Desoxinucleotídios trifosfatados