Engenharia

CLONAGEM MOLECULAR
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o Purificação e análise de DNA
A clonagem de certo gene passa, em primeiro lugar, pela extração da sua sequência nucleotídica numa base de dados. Depois de se obter a sequência do gene de interesse e de se isolar o DNA genómico, desenha-se oligonucleótidos denominados por primers para posteriormente efetuar a amplificação do fragmento por PCR, de forma a obter mais quantidade de DNA e consequentemente aumentar a probabilidade de união ao vector.

o Enzimas e Manipulação de DNA
De fato, verificou-se que as endonucleases, outra denominação atribuída às enzimas de restrição, tinham a capacidade de clivar o DNA em sequências específicas, pois catalisavam a quebra da ligação fosfodiéster existente entre dois nucleótidos adjacentes. Isto permite o manuseamento do genoma, obtendo-se fragmentos génicos de interesse. Geralmente, as regiões onde as enzimas cortam são regiões palindrómicas, ou seja, têm um eixo de simetria onde a sequência de bases de uma cadeia de DNA é a mesma da cadeia complementar, quando lida na direção oposta. As extremidades resultantes do corte podem ter dois modelos, cegas ou coesivas, conforme o tipo de corte efetuado pela endonuclease.

o Vetores de Clonagem
Os vectores são moléculas de DNA que servem de veículo de transporte do fragmento de interesse para as células hospedeiras e que possui certas características que permitirão uma clonagem de sucesso. Dessas características destacam-se:
- Capacidade de se autorreplicar e assim aumentar o número de cópias do vector e consequentemente do gene;
- Tamanho relativamente pequeno, aumentando desta forma a probabilidade de inserção do vector na célula hospedeira;
- Presença de um marcador seletivo que permita a distinção das células transformadas;
- Facilidade de recuperação a partir da célula hospedeira.

 Tipos de vetores:

Plasmídeos
Os Plasmídeos são moléculas de DNA circular extra cromossômico proveniente de bactérias. Estes vectores são