Eletroforese

ELETROFORESE Monitor: Cristina Grumann A eletroforese é uma técnica de separação de partículas de acordo com sua carga elétrica e peso molecular. Permite a separação de frações de moléculas orgânicas como RNA, DNA, proteínas e enzimas, pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico. O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, por exemplo, baseiase na carga total negativa do DNA (dada pelos oxigênios do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao polo positivo. Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade de migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrerão uma distância maior ficando mais próximas do pólo positivo. Na técnica, utiliza-se um cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos determinam os pólos positivo e negativo em cada compartimento. Neles, coloca-se uma solução salina que conduz eletricidade. Entre os compartimentos, ajusta-se o gel que deve ficar submerso. As amostras (de DNA, por exemplo) são colocadas com pipetas em pequenos poços no gel, que foram feitos com um pente durante a sua preparação. Antes, porém, elas são misturadas a um corante, chamado gel loading buffer. Esse corante é uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poços, além de dar a coloração que serve como indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplicase voltagem e corrente elétrica ao sistema. A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no