Colorações para microscopia

COLORAÇÕES PARA MICROSCOPIA

OBJETIVOS
Os objetivos desta aula são executar os métodos de coloração de Gram, Wirtz Conklin (para esporos), e azul de metileno para viabilidade de leveduras, permitindo a familiarização do acadêmico com técnicas rotineiras empregadas no âmbito da microbiologia.
MATERIAL
- Microscópios ópticos
- Óleo de imersão;
- Lâminas para microscopia imersas em álcool etílico
- pinças
- Alças e agulhas bacteriológicas
- Lápis demográfico
- 1 placa de Ágar Nutriente cultivada com S. aureus
- 1 placas de Ágar EMB cultivada com enterobactérias
- 1 placa de Ágar DRBC cultivada com fungos filamentosos e leveduras (isolados de frutos ou grãos de cereais)
- Corantes e reagentes do Gram: Cristal violeta, lugol, álcool comercial; fucsina de Ziehl diluída a 1/10
- Suportes para coloração de lâminas
- pipetas Pasteur
- 8 tubos com solução salina a 0,85%
- Frascos com álcool iodado
- Papel toalha
PROCEDIMENTO
Higienização das mãos antes e após o início das atividades.
a) Colocar uma gota de solução salina no centro da lâmina;
b) Retirar, com auxílio de uma alça de platina flambadae fria, uma porção da cultura bacteriana;
c) Espalhar uniformemente o material na lâmina limpa e flambada;
d) Deixar o esfregaço secar ao ar, fixá-lo pela passagem rápida da face da lâmina sobre a chama, por duas a três vezes;
e) Cobrir todo o esfregaço com uma solução de cristal violeta por 1 minuto;
f) Escorrer o excesso de corante, lavar cuidadosamente com água, drenando o excesso;
g) Aplicar a solução de lugol por 1 minuto, escorrer o excesso e lavar com água;
h) Descorar com álcool, adicionando-se gotas rápidas e, cuidadosamente, lavar com água;
i) Cobrir o esfregaço com fucsina por 30 a 60 segundos, escorrer o excesso, lavar em água e secar ao ar (ou no calor da chama);
j) Examinar com objetiva de imersão;
k) Verificar se a cultura está pura, observando forma, tamanho e a reação de Gram.

COLORAÇÃO À FRESCO PARA LEVEDURAS (VIABILIDADE