Clonagem Molecular

Clonagem molecular
Introdução
A clonagem molecular é a técnica usada para obter isolar e replicar um determinado fragmento de DNA de interesse, como por exemplo um gene.
Clonagem molecular – método clássico:
1.
Em primeiro, antes de qualquer outra procedimento, é necessário extrair o DNA e o vetor. Os vetores são moléculas que irão carregar o fragmento de DNA de interesse.
Há algumas características que se devem ter em conta quando se escolhe um vetor:
 Tem de ter a sua própria origem de replicação, garantindo que ele é capaz de se replicar autonomamente na célula hospedeira
 Ser de pequenas dimensões, para facilitar o isolamento e manipulação
 Ter pelo menos um marcador seletivo, que vai permitir distinguir e selecionar os clones recombinantes (ex: gene que codifique a resistência a um determinado antibiótico)
Os vetores mais comuns são os plasmídeos de bactérias, mas podem também ser usados outros, como por exemplo bacteriófagos.
2.
De seguida procede-se à fragmentação do DNA com uma enzima de restrição
(endonuclease), que cinde a cadeia de DNA quando encontra uma sequência de pares de base específica (zona de restrição) obtendo o fragmento de DNA que se pretende inserir no vetor. Mas, para tal, é necessário cortar também o vetor com a mesma enzima de restrição. No entanto, o plasmídeo tem apenas uma zona de restrição.
3.
Depois, junta-se o DNA e o vetor com uma DNA ligase, que vai liga-los covalentemente, dando origem ao DNA recombinante.
4.
De seguida é necessário inserir o DNA recombinante nas células hospedeiras, geralmente bactérias ou leveduras, para que este seja replicado. À semelhança da escolha do vetor, também a escolha do hospedeiro deverá ter alguns pontos em conta.
Este deve:
 ser capaz de crescer rapidamente, mesmo num meio de cultura pobre
 ser não patogénico
 ser geneticamente estável em cultura
 ter as enzimas necessárias para a replicação do vetor
 ser fácil de manipular

Há várias formas de inserir