bacteria

Microscopia
Imunohistoquimica
Microscopia de Fluorescência

2002/2003

Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas de Imunologia

Processamento de amostras
Amostras Congeladas

Amostras fixadas
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Fixação
Parafinação
Armazenamento RT

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Preparar lâmina (silano, etc)
Cortar 4-6m
Retirar parafina
Rehidratar
Recuperar Ag marcar 2002/2003

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Retirar gordura e tecido conectivo
1.5 cm2 x 0.5 cm
Transportar em MEM/RPMI 4ºC
Embeber (até 1 h pós colheita)
Armazenar –70ºC
Preparar Lâmina
Cortar 4-5m
Fixar com paraformaldeido a 1% marcar Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas de Imunologia

Corte de tecidos

2002/2003

Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas de Imunologia

Fixação
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Formaldeído
 Método de eleição
 Mecanismo preciso desconhecido, mas envolve
“crosslinking”
Utiliza-se habitualmente Formaldeído 3.7% pH neutro
 Responsável por “epitope masking”
 Amostras com cerca de 1.0 x 1.0 x 0.3 cm colocadas numa cassete e imersas em 20 volumes de fixador por 12 a 24 h
 Transferir para Et-oh 70% até processar
Alcool
 Muito menos utilizado


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2002/2003

Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas de Imunologia

Congelação
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Remover excesso de MEM/RPMI tocando em papel
Embeber em O.C.T. em molde
Congelar durante 20 a 30 segundos em
 banho de isopentano arrefecido com
 Azoto liquido (-135 a -140ºC)
 Gelo seco (-30ºC)
 Banho de congelação de tecidos (-52ºC)
Remover excesso de O.C.T. Com bisturi
Congelar a –70ºC / -80ºC

2002/2003

Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas de Imunologia

Recuperação de Antigénios
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Aumenta a sensibilidade da imunohistoquimica
Reverte parcialmente o mascarar de Ag devido à fixação
Mecanismo preciso não é conhecido mas envolve a quebra de
“crosslinks” entre proteínas envolvendo ou não Ca 2+
Envolve habitualmente a utilização de calor( 100ºC) durante
20 min.
Soluções:
 10