Bacharel Biotecnologia

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE DOENÇAS INFECCIOSAS

ARTIGO
Comparison of Nested PCR with Immunofluorescent-Antibody
Assay for Detection of Ehrlichia canis Infection in
Dogs Treated with Doxycycline

Renata Aline

Dra. Renata de Lima

Sorocaba/SP
Outubro de 2013.

Introdução

Erliquiose canina é uma doença causada pelo patógeno intracelular Ehrlichia canis, a doença ocorre geralmente em áreas tropicais e subtropicais e o principal vetor de transmissão desse patógen é o Rhipicephalus sanguineus, o carrapato marrom.
Como forma de tratamento a Doxiciclina e administrada oralmente em cães infectados, mas é preciso primeiro detectar a infecção, e o teste utilizado para essa detecção é o Teste de Imunofluorescência de Anticorpos.
O problema está em que mesmo após o período de infecção os animais infectados permanecem com anticorpos positivos para a doença, então mesmo que o teste tenha sensibilidade para a bactéria, ele não é útil para a determinação o estado atual do animal.
Portanto, foi desenvolvido um PCR para a detecção do DNA de E. canis a partir de amostras sanguíneas de animais infectados

PROTOCOLO
• Cultivar Ehrlichia ssp, E. canis, E. muris, E. chaeffeensis, Neoreckettsia helminthoeca e um agente de espuma
• Inocular cães com E. canis (Todos negativos para a bactéria anteriormente)
• Esperar 7 dias
• Coletar amostras de sangue
• Separar células mononucleares e manter a 280ºC
• Colocar 2 a 5 ml das amostras sanguíneas em tubos com EDTA
• Centrifugar amostras a 2500g por 5 min
• Guardar plasma para teste de IFA
• Colher 200 µl da camada de buffy coat para PCR
•
Extração de DNA
• Fazer extração usando 200 µl de buffy coat
• Extrair DNA com QIAamp Tissue Kit
• Suspender DNA em 50 µl de água

PCR
• Pipetar 0,5 a 1 µl de DNA, 10 x tampão, 2,5 U, 0,5 µl de MgCl2 a 50 Mm, 1 µl de Dntp a 10 Mm e 2 pmol de cada primer.

Primers Sequência

ECC

ECB

5’-AGAACGAACGCTGGCGGCAAGCC-3’

5’-CGTATTACC