assim como se foi

sequencia de bases em aminoácidos:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ -> blast -> blastx -> botão blast pra traduzir ai depois de uma eternidade, vc clica na primeira barra em vermelho, depois em 'sequence ID' depois em 'fasta'

joga essa sequencia em http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ -> submit -> lá em baixo vai ter a quantidade de aminoácidos que vc vai tirar que é o peptidio sinal, ai vc multiplica por 3 e tira essa quantidade de bases. com esse resultado vc faz seu primer, primeiro vc pega as 30 ultimas bases e joga no http://bioinformatics.org/sms/rev_comp.html a sequencia ja vai estar no complement 5' - 3' ai vc joga essa sequencia e a sequencia das 30 primeiras bases no http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome pra ver se alinhou, normalmente sim, é meio desnecessário essa etapa, ai vc vai com essas mesmas duas sequencias em joga cada uma numa pagina do http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ . Ai vc vai determinar a Tm, a sequencia com maior tm vc vai tirando base da direita pra esquerda ate ficar proxima da sequencia com menor tm.

ai vc tem que determinar o sitio que vc vai usar do vetor, pra isso vc joga a sua proteina sem o peptidio sinal no nebcutter e lá vai aparecer os sitios que a proteina tem, ai vc ve a que tem no seu vetor e que nao tem na proteina e escolhe esse, um pra cada primer, ai vc joga esses que vc escolheu no site da biolabs e ve a sequencia dele e incorpora no seus primers. Pronto, agora tem q responder as questoes, que tmb precisa de uns sites, mas nao fiz ainda.