Western Blot

Western Blot
Protocolo

Para linfócito e neutrófilo, separar 1x107 células – adicionar 120 µL de tampão RIPA (“no gelo”);

Para tecido adiposo, separar aproximadamente 250 µL do meio contendo adipócitos – adicionar 300 µL de tampão RIPA (“no gelo”);

Para 100 mg de fígado - adicionar 500 µL de tampão RIPA (“no gelo”);

Quando necessário, estimular as células com PMA (100 ng); LPS (50 µL de uma solução de 1mg por mL) ou outros estímulos no banho seco 200 rpm, por 15 minutos;

Após separar a quantidade necessária de célula ou tecido e acrescentar o tampão RIPA:

Para as células sonicá-las por 3 x 10 segundos;

Para os tecidos utilizar o homogenizador de tecidos usar na velocidade máxima, o que equivale ao número 6 e homogeneizar 5 x 10 segundos ou quanto achar necessário para uma homogeneização completa;

O procedimento de sonicação deverá ser feito “no gelo”;

Centrifugar as amostras a 12.000 g x 10 min x 4ºC;

Retirar o sobrenadante e descartar o pellet; Para adipócitos, retirar o infranadante. Reservar em eppendorfs;

Retirar desse homogenato, 10 µL para a dosagem de proteína;

Dosar a proteína por Bradford;

As amostras das células e tecidos são armazenadas no -80ºC em tampão RIPA;

Calcular a quantidade de proteína a ser pipetada no gel a partir da dosagem da mesma por Bradford.

Geralmente para cada poço no gel utilizamos 30 µg de proteína;

Acrescentar à amostra o tampão Laemmli (5x).

Não diluir o tampão: observar o volume da amostra e dividir por quatro e o resultado acrescentar de Laemmli na amostra, assim esse tampão estará (1x);

Acrescentar 5% na amostra de β-MCE;

Colocar as amostras no banho seco, 200 rpm a 100ºC por cinco minutos;

Colocar na cuba de “corrida” já com o gel, o tampão de corrida até ultrapassar o gel para posterior pipetagem;

Pipetar no primeiro poço do gel 5 µL de padrão (-20ºC com já com Laemmli). Não aquecer o padrão é só pipetar diretamente no poço do gel;

Após o padrão, pipetar as