Quimica

INTRODUÇÃO

Os métodos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos consistem de três etapas: (1) lise das células e solubilização do DNA ou RNA; (2) método enzimático ou químico para remover as proteínas contaminantes e outras macromoléculas; e (3) precipitação alcoólica para isolamento do DNA. Os protocolos básicos geralmente são aplicáveis a um ampla variedade de materiais.
O método básico compreende a ruptura do tecido com um homogeneizador, a lise celular com o detergente iônico SDS, extração fenólica das proteínas e precipitação etanólica do DNA. Este método é útil para preparação de DNA genômico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mínimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA genômico produzido é adequado para amplificação por PCR ou para a digestão com enzimas de restrição e análise de transferência de DNA. Uma quantidade substancial de RNA acompanha o DNA genômico, o que dificulta a quantificação por espectroscopia no UV. Algumas amostras de DNA não amplificam bem por PCR ou não são completamente digeridas com enzimas de restrição e devem, portanto, ser reextraida .
O protocolo mais adequado à rotina laboratorial para isolamento de DNA e RNA compreende a lise celular com SDS, remoção das proteínas por precipitação com cloreto de sódio concentrado e isolamento do DNA genômico por precipitação etanólica.

O método mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilização simultânea do tecido ou células e inativação de Rnases endógenas na presença de isotiocianato de guanidina, com subsequente separação do RNA do DNA e das proteínas por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio. Dois outros métodos que não requerem ultracentrifugação podem se utilizados: (1) lise com detergente não-iônico para proporcionar um método rápido para preparação de amostras de RNA citoplasmático e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoção das proteínas pela extração fenólica em pH ácido, seguida de