Pcr multiplex

Secção Autónoma das Ciências da Saúde da Universidade de Aveiro, Ciências Biomédicas Técnicas Laboratoriais em Biomedicina, ano letivo 2011/12

Amplificação de fragmentos de DNA por PCR multiplex e análise por Eletroforese
Introdução
PCR – Contextualização teórica
A reação de polimerase em cadeia, ou PCR (polimerase chain reaction), é uma técnica de biologia molecular que se baseia no processo de replicação do DNA que ocorre in vivo. Através de uma molécula de DNA é possível obter milhares de cópias de fragmentos dessa molécula. Baseia-se no uso de um termociclador (figura 1), que através de ciclos de aquecimento e arrefecimento permite a desnaturação da cadeia de DNA e reações enzimáticas de amplificação. Para ser aplicável, a técnica de PCR requer o conhecimento de nucleótidos ou de uma pequena sequência do fragmento de DNA a amplificar, pois há necessidade de preparar oligonucleótidos iniciais (primers), complementares das sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3’, de modo a permitir a atuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das cadeias simples constituintes do DNA a amplificar 1,2. Uma PCR básica requer vários componentes e reagentes: o molde do DNA a amplificar; um primer reverse e um forward; uma DNA polimerase (normalmente, a taq polimerase produzida pela bactéria Thermus aquaticus, que tem a sua atuação ótima a 70 ºC); Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) que servem como substrato à DNA polimerase; uma solução tampão que cria um ambiente químico ótimo para a atuação da DNA polimerase e iões Potássio e Magnésio que servem como co-fatores da reação 1,2.
A PCR é um método bastante sensível, daí ser bastante propenso a que ocorram erros. Fatores como as “hairpins” (estrutura secundária das moléculas de DNA), erros da polimerase, a concentração de magnésio, o tamanho do fragmento a amplificar, a ligação inespecífica dos primers, ligação do primer reverse ao