PCR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE
PCR

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
Objetivo:
• Aumentar o número de cópias do DNA a ser estudado

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
Aplicações:
• Na identificação e tratamento de doenças condicionadas geneticamente; • No diagnóstico muito sensível e específico de doenças infecciosas e parasitárias;
• No diagnóstico do câncer;
• Na manipulação terapêutica de genes;
• No teste de paternidade;
• Na indústria farmacêutica;
• Em estudos evolutivos e de descendência;
• Na medicina legal, etc.

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

- Como funciona?
-DNA polimerase (Thermus aquaticus)
- Mudança de temperatura (Termociclador)
- Outros reagentes:
• DNA molde,
• iniciador (primer)
• dNTPs (desoxinucleotídeos trifosfato:
A, C, G, T)
• MgCl2

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
3 Etapas:
-Desnaturação: 94ºC a 96ºC
Separação das duas fitas
-Temperatura de anelamento (TM): 50ºC a 65ºC
Especificidade na ligação do iniciador
-Extensão: 72ºC
Síntese da nova fita

PCR

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

PCR

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

Verificação do produto de PCR Eletroforese

VARIAÇÕES DA TÉCNICA
Enzima
dNTPs

DNA molde

Tampão

Condições da PCR

• Concentração de sal
• Tipo de sal
• MgCl2

• Temperatura
• Tempo
Iniciadores
“primers”

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
Variações da técnica:
-RT-PCR
-PCR em tempo real (real time PCR)
-Nested-PCR
-RAPD
-RFLP-PCR
-PCR-MULTIPLEX

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
Variações da PCR:

- RT-PCR (PCR- transcriptase reversa): detecção de
RNA viral e análise de expressão gênica;

RT PCR

(“Reverse Trasncriptase PCR”)

Duas reações:
• Transcrição reversa RNA
• PCR comum

cDNA

Amplifica os genes (fragmentos de genes) que estão sendo expressos num
determinado