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Teste de expressão de proteínas, purificação de proteínas, preparação do gel de proteínas SDS-page.
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

2. MATERIAIS
Ampicilina;
Incubadora/shaker;
Centrífuga;
IPTG;
Tampão A: 50mM Tris HCl pH 7,5; 100mM NaCl; 1mM PMSF (inibidor de proteases); 0,3 mL de β-mercaptoetanol por L; 5-10 mM imidazol (para inibir ligações inespecíficas);
Tampão B: Tris HCl pH 7,5; NaCl, imidazol.
Tampão de lise: Tampão A; 1% Brij; ponta de espátula de DNAse; ponta de espátula de lisozima;
Tampão de amostra de proteínas;
Beads de níquel;
Gelo
Pipetas de 10, 100 e 1000 µL, ponteiras de 10, 100 e 1000 µL;
Microtubos de 2 mL e 1,5 mL;
Descarte para insumos de plástico e descarte para material líquido;
Vortex;
Chapa de aquecimento.
3. MÉTODOS
3.1. Teste de expressão de proteínas 1. O pré-inóculo foi diluído na proporção 1/50 em um caldo de LB com ampicilina e foi incubar a 37° com agitação a 180 rpm por 2 horas até atingir o OD600= 0,5; 2. Uma alíquota de 50 mL foi retirada antes da indução com o IPTG (amostra de 0h); 3. A amostra restante foi imediatamente centrifugada a 4500 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e a solução restante foi armazenada a -20°C; 4. A expressão foi induzida adicionando o IPTG ao meio, a concentração de IPTG usada foi a de 1 mM. 5. A solução foi incubada por 2 horas a 37°C sob agitação de 140 rpm; 6. Uma alíquota de 50 mL foi retirada, centrifugada a 4500 rpm, seu sobrenadante foi retirado e o restante foi armazenado a -20°C (amostra de 2h);

7. O inóculo restante foi reincubado por mais 2 horas; 8. Novamente foram retirados 50 mL, centrifugados a 4500 rpm, o sobrenadante foi retirado e o resto foi armazenado a -20°C (amostra de 4h); 9. O inóculo restante foi incubado por mais 2 horas; 10. 50 mL foram retirados, centrifugados, seu sobrenadante foi retirado e a solução restante foi armazenada a -20°C (amostra de 6h).
3.2. Purificação de proteínas
3.2.1. Lise 1. Os pellets coletados