Hibridização
Tipo de hibridização que utiliza cadeias complementares de DNA e RNA para localizar uma sequência específica de DNA/RNA numa porção ou secção de um tecido (in situ), em que a molécula repórter vai-se ligar. O primeiro protocolo deste tipo de hibridização data de 1969, sendo na altura descrito como um método de localização de híbridos de DNA-RNA em preparações citológicas (1). É extremamente especializada, já que um protocolo normal deste tipo de hibridização normalmente detecta entre 10 a 20 unidades de mRNA apenas numa célula.
Quando a porção de tecido é demasiado pequena (ex: sementes de plantas ou embriões de Drosophila), aplica-se a hibridização:
Em todo o tecido (whole mount ISH);
Em células e/ou células tumorais circulantes (CTCs);
Pode ser utilizada para:
Microbiologia – morfologia e estrutura populacional de microorganismos;
Patologia – perfil patogénico e expressão anormal de genes;
Desenvolvimento da Biologia – perfil de expressão génica em tecidos embrionários;
Análises carióticas e filogenéticas (perfis únicos de FISH);
Outras...
Tipos de hibridização in-situ:
CISH – Chromogenic in-situ hybridization
Visualiza-se reacções de peroxidase e fosfatase alcalina através de um microscópio óptico comum. Esta técnica é aplicável em sangue, “esfregaços” de medula óssea, células fixas...
FISH – Fluorescence in-situ hybridization
Desenvolvida por volta da década de ’80 (2), é maioritariamente utilizada para localizar e detectar a presença de sequências específicas de DNA em cromossomas.
Procedimento geral:
Depois dos ácidos nucleicos-alvo estarem em condições (fixados em tecidos, CTCs...), podem ser detectados utilizando-se sondas constituídas por DNA complementar ou por RNA complementar (ribossonda - + frequente actualmente) ao objecto em estudo;
As sondas hibridizam para a sequência-alvo numa temperatura elevada, são removidas posteriormente as sondas em excesso;
(Mencionar parâmetros – temperatura, sal,