Geração vaccinia virus recombinante

GERAÇÃO DE VACCINIA VIRUS MUTADOS ATRAVÉS DA REMOÇÃO DO GENE CODIFICADOR DA PROTEÍNA HOMÓLOGA AO RECEPTOR SOLÚVEL PARA INTERFERON TIPOI

Trinta anos após a erradicação da varíola, o interesse nas infecções causadas pelos Orthopoxvirus (OPXV) tem aumentado devido ao potencial uso do Variola virus como arma biológica e o aumento nos casos de infecções zoonóticas causadas por Poxvirus pelo mundo todo. A amostra viral Vaccinia vírus Western Reserve (VACV-WR), pertencente ao gênero OPXV, consiste de uma amostra adaptada ao modelo murino através de repetidas passagens em camundongos, o que a tornou altamente virulenta nestes animais quando inoculada pela via intranasal. Assim, o VACV-WR tornou-se um excelente modelo para se estudar a resposta imune desencadeada por esses vírus em modelo murino. Os OPXV expressam genes que codificam proteínas capazes de modular a resposta imune do hospedeiro. Dentre esses genes, podemos citar o gene WR-200 que é responsável por codificar receptores solúveis para interferon tipoI (α/β). Ao se estudar esse gene isoladamente, podemos entender que papel exerce na virulência da amostra viral e na modulação da resposta imune do hospedeiro. Portanto, o objetivo desse trabalho foi a remoção desse gene do vírus WR e a verificação do fenótipo viral resultante em modelo murino. Para isso, regiões flanqueadoras do gene WR-200 no genoma de VACV-WR, denominadas flanco 1 e flanco 2, foram amplificados por PCR, utilizando iniciadores específicos. Posteriormente, os flancos foram clonados no plasmídeo pZippy-NEO/GUS que contém uma cópia do gene de resistência a neomicina e uma cópia do gene codificador da β-glucurinidase. Os produtos codificados por estes genes auxiliarão na posterior seleção dos vírus recombinantes. Os DNAs plasmidiais extraídos de algumas culturas identificadas como positivas para a presença do inserto foram submetidos ao seqüenciamento e o clone escolhido será utilizado para gerar vírus recombinantes, que terão o gene WR-200