Extra O DNA E Eletroforese

Extração de DNA e Técnica de
Eletroforese

Extração de ácidos nucléicos
Requerimento essencial:
• quantidade
• pureza
• integridade
Etapas na obtenção de ácidos nucléicos:
• Lise física ou bioquímica das paredes celulares e membranas • Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares
• Precipitação

Extração de ácidos nucléicos
1. Rompendo

membranas celulares

Lise das células  liberação dos componentes citoplasmáticos e/ou nucleares
- bactérias (parede glicoproteica)  tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede  enfraquecimento
 rompimento em solução hipotônica); outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação Extração de ácidos nucléicos
Células de plantas ou animais presentes em tecidos:
•
•

Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual  célula individual  lise: digestão enzimática / homogeneização
Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.

Extração de ácidos nucléicos
Células sem cobertura externa ou em solução:
Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente SDS
(SODIUM DODECYL SULFATE) – dodecil sulfato de sódio  substâncias tenso ativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas solução de lise: NH4Cl / NH4HCO3

2. Desnaturando proteínas celulares:
Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas:
- DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos.
Fragmentos de membrana lipídica
Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas –
DNAses / RNAses  interferem no rendimento dos ácidos nucléicos Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos:
Extração em baixas temperaturas
Incubação dos lisados com reagentes desnaturan- tes de proteínas Extração de ácidos nucléicos
Agentes que retardam atividade das nucleases: tampões de extração com agentes quelantes (EDTA
– ácido etileno diaminotetracético)
- Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico  desnaturam nucleases e coagulam