Catalase 2014 BC

BIOLOGIA CELULAR

CINÉTICA ENZIMÁTICA

I - ENSAIO DA ACTIVIDADE CAT NO FÍGADO DE PORCO
A - SOLUÇÃO-TAMPÃO
Preparar 500 ml de tampão fosfato potássico 70 mM, pH 7,0 (Tp).
B - PREPARAÇÃO DO EXTRACTO ENZIMÁTICO
1 - Pesar 0,5 g de tecido hepático e homogeneizar, num almofariz, com 10 ml de solução Tp;
2 - Transferir o homogeneizado para tubos de centrífuga e centrifugar a 15000 xg durante 15 minutos;
3 - Retirar 50 l do sobrenadante e diluir para 25 ml em solução Tp. O extracto diluído (E) será utilizado nos ensaios de actividade enzimática.
C - AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE CAT
A actividade CAT é avaliada seguindo o decréscimo de absorvância a 240 nm, que acompanha a decomposição do H2O2 na presença do extracto enzimático. 2 H2O2
2 H2O + O2

1 - Numa cuvette de quartzo, preparar a seguinte mistura de reacção:
• 400 l de solução S (*);
• 500 l de solução Tp;
• 100 l de extracto E.
(*) 170 l H2O2 a 30% / 50 ml Tp

2 - Anotar os valores de absorvância da mistura de ensaio num com intervalos de 20 segundos, ao longo de 1 minuto;

= 240 nm,

3 - Determinar a actividade CAT do extracto E (expressando-a em U / ml) e o nº de Unidades de enzima existente por grama de tecido hepático.
(1U = decréscimo de 0,05 unidades de absorvância por minuto)

II - INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA
Realizar o ensaio da actividade CAT utilizando as misturas de reacção indicadas na TABELA I.
TABELA I

S ( l)

Tp ( l)

E ( l)

400

550

50

400

500

100

400

400

200

III - INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO
Realizar o ensaio da actividade CAT utilizando as misturas de reacção indicadas na TABELA II.
TABELA II

S ( l)

Tp ( l)

E ( l)

200

700

100

400

500

100

800

100

100

IV - INFLUÊNCIA DO TEMPO DE REACÇÃO
Realizar o ensaio da actividade CAT procedendo a leituras espectrofotométricas a intervalos de 10 segundos durante o 1º minuto e prolongando o tempo de reacção até aos 2 minutos.