Renaturaçao e desnatraçao

Desnaturação e Renaturação do DNA

Os termos desnaturação e renaturação são sinônimos de fusão e reanelamento, respectivamente.

Esses fenômenos físicos que ocorrem com o DNA dupla-hélice são fundamentais para os processos de replicação, transcrição e recombinação.

A desnaturação ocorre quando as pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA são rompidas e as fitas se separam.

A desnaturação da estrutura secundária do DNA pode ser obtida: • aumento de temperatura • titulação com substâncias ácidas ou álcalis • por agentes desnaturantes como a formamida e o dimetil sulfóxido (DMSO).

Os ácidos protonizam os anéis nitrogenados de A, G e C e os álcalis desprotonizam os anéis nitrogenados de G e T. Esses tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla-hélice, o que leva ao rompimento das pontes de hidrogênio entre as bases complementares. Como as ligações glicosídicas nas purinas que são sensíveis ao pH baixo, a desnaturação por ácido tem pouca aplicação prática.

A desnaturação do DNA pode ser acompanhada pela medida em espectrofotômetro da absorbância (260 nm) da luz ultravioleta (UV). As bases nitrogenadas são responsáveis pela maior parte dessa absorção.

Fitas completamente separadas – A260nm = 37% maior que o DNA na sua forma nativa.
A temperatura na qual 50% do DNA se encontra desnaturado é chamado de Tm.

Para romper um par GC é necessário:uma temperatura mais elevada , pH mais alto ou maiores concentrações de agentes desnaturantes do que para separar um par AT.

Assim:

O Tm de um par DNA depende da proporção de AT em relação a GC.

Tm ((C) = 69,3 + 0,41 (GC%)

Mesmo quando as fitas do DNA está completamente separadas, o processo pode ser revertido. A renaturação do DNA tb pode ser acompanhada por espectrofotometria.

Dna desnaturado por calor for lentamente resfriado as fitas complementares se reassociam e a absorção a 260 nm diminui. Esse anelamento ocorre normalmente 25(C abaixo da