randombulshittogetmesigned

ENZIMOLOGIA

ESTUDO CINÉTICO DA FOSFATASE ALCALINA: ACÇÃO DE DIFERENTES TIPOS DE INIBIDORES.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:

1. Reagentes:

A - Solução “mãe” de fosfatase alcalina do intestino de bovino (E.C. 3.1.3.1). Efectuar uma diluição conveniente da solução comercial, com tampão Tris/HCl contendo 1mg/ml de albumina sérica de porco (PSA).

B – Solução “mãe” de p-nitrofenilfosfato (usar sal dissódico, hexahidratado) em tampão Tris/HCl.

C – Solução “mãe” de p-nitrofenol em tampão Tris/HCl.

D – Solução tampão de Tris/HCl (0,5 M) + MgCl2 (5 mM; usar sal hexahidratado), pH 9,0.

E – Solução “mãe” de NaH2PO4 (usar sal monohidratado) em tampão Tris/HCl.

F – Solução “mãe” de L-fenilalanina em tampão Tris/HCl.

Nota: Escolher concentrações adequadas das soluções “mãe”.

1ª PARTE:

2. Traçar uma curva de calibração, da absorvência em função da concentração de p-nitrofenol (pNF). Preparar soluções padrão de pNF, em tampão Tris/HCl, de concentrações convenientes e ler a absorvência a 400 nm (depois de descontar a absorvência do “branco”). Realizar triplicados.

3. Ensaios enzimáticos na ausência de inibidores:

3.1. Preparar soluções de p-nitrofenilfosfato (pNFF) em tampão Tris/HCl, em duplicado. Escolher uma gama de concentrações de pNFF adequada.

3.2. Iniciar a reacção por adição de solução de enzima em tampão Tris/HCl (preparada em 1.), à mistura reaccional. Agitar rapidamente no “vortex” e ligar o cronómetro. Transferir rapidamente a solução resultante para uma cuvete e ler a absorvência a 400 nm, de 15 em 15 s, durante pelo menos 3 min. Todos os ensaios são realizados à temperatura ambiente, a qual deve ser registada. Realizar duplicados.

Nota 1: O volume de solução de enzima a adicionar à mistura reaccional deve ser pequeno relativamente ao volume final da solução, para que se possa descontar a absorvência da mistura reaccional (sem a enzima) antes de se iniciar a leitura das absorvências.

4. Ensaios enzimáticos