dna recombinante

Tecnologia DNA recombinante
Biologia Molecular aplicada

Definição
• É a tecnologia que permite realizar a clonagem de genes em laboratório. Teve início com a descoberta das enzimas de restrição.
• As enzimas de restrição são naturalmente encontradas em seres humanos, porém são capazes de clivar DNA humano em locais específicos (sítios para enzimas de restrição).

Enzimas de restrição
A enzima HaeIII reconhece uma sequência de 4 nucleotídeos e produz cortes simétricos ("blunt").
A enzima BamHI reconhece uma sequência de 6 nucleotídeos e origina cortes assimétricos e coesivos (“sticky”).

ECORI (E. coli)
5 ’ G A AT T C 3 ’
3 ’ C T TA A G 5 ’

Construção DNA recombinante
• DNA recombinante é a mistura de 2 DNAs diferentes: o DNA de interesse e o DNA de um vetor de clonagem
• Vetor de clonagem é um DNA capaz de se multiplicar com facilidade em laboratórios

Etapas
1. Isolamento dos 2 DNAs: DNA de interesse e DNA de um vetor de clonagem;
2. Clivagem dos 2 DNAs com a mesma enzima de restrição para que sejam originadas as mesmas terminações;
3. União dos 2 DNAs na presença da ligase;
4. Devolução do vetor recombinante para o lugar de origem
(p.e. o plasmídeo volta para a bactéria);
5. O vetor recombinante irá se replicar originando várias cópias (clones do DNA de interesse)

Vetores
• Plasmídeo:
DNA
extra cromossômico encontrado em bactérias. Suporta até 10Kb de
DNA exógeno.

Vetores
• Bacteriófago: vírus que infecta bactérias.
Suporta até 20Kb de DNA exógeno.

Vetores
• Cosmídeos: são moléculas de DNA circulares extracromossomais que combinam as vantagens de um plasmídeo com a de um bacteriófago.
Suporta até 50Kb de DNA exógeno.

Vetores
• Cromossomos artificiais de levedura: Suporta até 1000Kb de DNA exógeno.

Algumas definições
• Clonar é um processo no qual se insere um fragmento de DNA num plasmídeo ou no cromossomo de um fago, bactéria, levedura, etc...
• Fragmento de DNA ou Inserto são