Biologia molecular celular

Objectivos
Métodos

Material biológico

1. Isolamento de DNA plasmídico
-propagação da cultura bacteriana

Meio LB, ampicilina, escherichia coli Solução1: glucose, Tris.Cl, EDTA Solução2:NaOH, SDS Solução3:acetato de potássio, ácido acético glacial, Etanol absoluto Etanol a 70%, tampão TE, RNase

-centrifugação e lise alcalina da bactéria -precipitação do DNA plasmídico e remoção do RNA

2. Quantificação de ácidos nucleícos
- espectrofotometria nos UV - espectro de absorção
Tampão TE

impureza do DNA
- método da placa de agarose
Agarose em tampão tris-acetato (TAE), brometo de etídio

-concentração de DNA.

Avaliação e discussão de resultados

• Pela espectrofotometria UV:

Fig.1 - RNase

Fig.2 - TE

Teoricamente o valor da A₂₆₀ (RNase) < A₂₆₀ (TE). Para além disso existe um pico próximo de 230, o que indica a presença de etanol.
Tabela 1

Amostra TE RNase

A₂₃₀

A₂₆₀

A₂₈₀

A₂₆₀/A₂₈₀ 2.143 1.998

A₂₆₀/A₂₃₀ 1.681 1.667

Concentração (μg/ml) 3825 4085

0.455 0.765 0.357 0.490 0.817 0.409

Para o DNA ser puro:

- A₂₆₀/A₂₈₀ ϵ [1.8 , 2] - A₂₆₀/A₂₃₀ ϵ [1.8 , 2.2]

Na amostra sem RNase: A₂₆₀/A₂₈₀ está ligeiramente acima do limite máximo, o que indica presença de DNA degradado, enquanto que A₂₆₀/A₂₃₀ está abaixo, o que indica que a amostra está contaminado com etanol. Na amostra com Rnase: -A₂₆₀/A₂₈₀ está dentro do valor esperado, logo, podemos afirmar que o DNA está puro. -- A₂₆₀/A₂₃₀ está abaixo do valor esperado, logo há contaminação com etanol.

• Pela electroforese:
1 2

3

4

1. Amostra sem RNase 2. Amostra com Rnase 3. DNA linear (pGEM3Z + SacI ) 4. DNA superenrolado (pGEM3Z kit intacto)

Peso Molecular do DNA
4.5 4

3.5
3 2.5 Log (PM) 2 1.5 1 0.5 0

15

16

18

20.5

23.5

28

31

36

48.5

55

59

65

73

85

d (mm)

Pela análise do gráfico podemos concluir que o peso molecular do DNA é: 10^(3,602)= 3999 kDa

Bibliografia
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