Tecnica MTT

1. Princípio
Este ensaio baseia-se na medida do dano induzido pelo composto/extrato em estudo no metabolismo celular de glicídeos usualmente através da avaliação da atividade de desidrogenases mitocondriais. A viabilidade mitocondrial, e conseqüentemente, a viabilidade celular, é quantificada pela redução do MTT (um sal de coloração amarela e solúvel em água) a formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em água) pela atividade daquelas enzimas. Dessa forma, a redução do MTT a formazan, será diretamente proporcional à atividade mitocondrial e a viabilidade celular. 2. Amostra
Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo.
3. Reagentes/soluções/ suspensão celular
3.1. Meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SBF) e solução de antibióticos (penicilina 10.000u/mL e estreptomicina 10.000µg/mL) Normalmente, para células aderentes, é utilizado o meio DMEM simples ou rico em glicose, o qual deve ser suplementado com SFB (10%) e solução de antibióticos (1%).
3.2. Solução de MTT (0,5mg/mL) Para preparar de 10 mL da solução de MTT (0,5mg/mL), proceder da seguinte maneira:
1- Preparo da solução estoque a 5mg/mL: Pesar 5mg de MTT e solubilizar em 1 mL de PBS estéril.
2- Preparo da solução 0,5mg/mL:
CV=CV
5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL
V= 1 mL da solução estoque
Dessa forma, para preparar 10 mL da solução a 0,5mg/mL deve-se utilizar 1 mL da solução estoque e adicionar 9 mL de meio completo.
Observações: Este cálculo mostra as quantidades de solução estoque, PBS estéril e de meio completo necessários para preparar 10 mL da solução de MTT a 0,5mg/mL, que refere-se à quantidade necessária para executar o ensaio em uma placa de 96 poços completa. Se você não for utilizar uma placa inteira, reajustar os cálculos!
3.3. Suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL Para preparar uma suspensão celular (0,5X105 células/mL), proceder da seguinte maneira:
1- Determinar