Extração e purifição do DNA

Extração e purificação do DNA

Etapas:
1) Rompimento do envoltório celular; - Abrasão física, ação enzimática, detergentes, pressão osmótica, aquecimento. OBS: Destruir enzimas capazes de hidrolisar o DNA (DNases), utilizando Proteinases.
2) Eliminar os outros ácidos nucléicos (RNA); - Adição da enzima RNase, hidrolisando o RNA. OBS: O tratamento com RNase é extremamente necessário quando se pretende realizar o experimento de hibridação de DNA.
3) Remoção dos contaminantes; - RNA, proteínas, carboidratos, oligoelementos, lipídios; - Pode ser realizado por duas maneiras: - Fenol/Clorofórmio: Quando iremos extrair o DNA, os contaminantes estão todos degradados, formando complexos insolúveis, podendo ser removidos quando adicionado Fenol/Clorofórmio na amostra, a seguir a solução é agitada e centrifugada, logo teremos duas fases específicas: na parte superior obtemos uma fase aquosa onde encontra-se o DNA e na parte inferior, uma fase orgânica onde encontram-se os complexos insolúveis, o Fenol/Clorofórmio são dois solventes orgânicos, ou seja, são lipossolúveis, como temos complexos insolúveis em água, quando adicionamos o Fenol/Clorofórmio e agitamos formam-se complexos com Fenol e Clorofórmio. Estes vão deslocar-se para fase orgânica, sendo assim, o DNA encontrado na fase aquosa é retirado do tubo e transferido para outro tubo.
OBS: Tanto o DNA como o RNA íntegros podem ficar retidos na fase aquosa dependendo do pH da mistura do Fenol/Clorofórmio: pH entre 4 e 6 da mistura somente o RNA fica retido na fase aquosa e o DNA na fase orgânica; pH entre 7 e 8 da mistura o DNA e o RNA ficam retidos na fase aquosa.
OBS2: O DNA também pode ser isolado utilizando uma solução extremamente concentrada de NaCl (5 M); Precipitando todas as macromoléculas que formaram os agregados. - Coluna de absorção do DNA: Na solução encontra-se o DNA e os complexos insolúveis, transferimos essa solução para um outro tubo que possui a coluna de absorção acoplada. A coluna de